Abstract Here we report the design, construction and characterization of a tRNA neochromosome, a designer chromosome that functions as an additional, de novo counterpart to the native complement of Saccharomyces cerevisiae . Intending to address one of the central design principles of the Sc2.0 project, the ∼190 kb tRNA neochromosome houses all 275 relocated nuclear tRNA genes. To maximize stability, the design incorporated orthogonal genetic elements from non- S. cerevisiae yeast species. Furthermore, the presence of 283 rox recombination sites enable an orthogonal SCRaMbLE system capable of adjusting tRNA abundance. Following construction, we obtained evidence of a potent selective force once the neochromosome was introduced into yeast cells, manifesting as a spontaneous doubling in cell ploidy. Furthermore, tRNA sequencing, transcriptomics, proteomics, nucleosome mapping, replication profiling, FISH and Hi-C were undertaken to investigate questions of tRNA neochromosome behavior and function. Its construction demonstrates the remarkable tractability of the yeast model and opens up new opportunities to directly test hypotheses surrounding these essential non-coding RNAs. Highlights De novo design, construction and functional characterization of a neochromosome containing all 275 nuclear tRNA genes of Saccharomyces cerevisiae . Increasing the copy number of the 275 highly expressed tRNA genes causes cellular burden, which the host cell likely buffers either by selecting for partial tRNA neochromosome deletions or by increasing its ploidy. The tRNA neochromosome can be chemically extracted and transformed into new strain backgrounds, enabling its transplantation into multi-synthetic chromosome strains to finalize the Sc2.0 strain. Comprehensive functional characterization does not pinpoint a singular cause for the cellular burden caused by the tRNA neochromosome, but does reveal novel insights into its tRNA and structural chromosome biology.

SUMMARY Cellular responses to environmental stress are frequently mediated by RNA-binding proteins (RBPs). Here, we examined global RBP dynamics in Saccharomyces cerevisiae in response to glucose starvation and heat shock. Each stress induced rapid remodeling of the RNA-protein interactome, without corresponding changes in RBP abundance. Consistent with general translation shutdown, ribosomal proteins contacting the mRNA showed decreased RNA-association. Among translation components, RNA-association was most reduced for initiation factors involved in 40S scanning (eIF4A, eIF4B, and Ded1), indicating a common mechanism of translational repression. In unstressed cells, eIF4A, eIF4B, and Ded1 primarily targeted the 5′-ends of mRNAs. Following glucose withdrawal, 5’-binding was abolished within 30sec, explaining the rapid translation shutdown, but mRNAs remained stable. Heat shock induced progressive loss of 5’ RNA-binding by initiation factors over ∼16min. Translation shutoff provoked selective 5′-degradation of mRNAs encoding translation-related factors, mediated by Xrn1. These results reveal mechanisms underlying translational control of gene expression during stress. Highlights A quantitative proteomic approach reveals rapid stress-induced changes in RNA-binding Translation shutdown is driven by loss of mRNA binding by scanning initiation factors eIF4B and Ded1 have key but separate roles in driving the stress response Heat shock invokes rapid RNA degradation by Xrn1, selective for translation machinery

Abstract RMRP encodes a non-coding RNA forming the core of the RNase MRP ribonucleoprotein complex. Mutations cause Cartilage Hair Hypoplasia (CHH), characterized by skeletal abnormalities and impaired T cell activation. Yeast RNase MRP cleaves a specific site in the pre-ribosomal RNA (pre-rRNA) during ribosome synthesis. CRISPR-mediated disruption of RMRP in human cells lines caused growth arrest, with pre-rRNA accumulation. Here, we analyzed disease-relevant primary cells, showing that mutations in RMRP impair mouse T cell activation and delay pre-rRNA processing. Patient-derived human fibroblasts with CHH-linked mutations showed similar pre-rRNA processing delay. Human cells engineered with the most common CHH mutation (70 AG in RMRP ) show specifically impaired pre-rRNA processing, resulting in reduced mature rRNA and a reduced ratio of cytosolic to mitochondrial ribosomes. Moreover, the 70 AG mutation caused a reduction in intact RNase MRP complexes. Together, these results indicate that CHH is a ribosomopathy, and the first processing-specific human disorder to be described. Highlights Mutations in RMRP lncRNA impair pre-rRNA processing and T cell activation Patient derived fibroblasts show impaired pre-rRNA processing Cells with the most common disease-linked mutation have specific processing defects Cytoplasmic ribosomes and intact RNase MRP complexes are also reduced in these cells

ABSTRACT Infection with SARS-CoV-2 is expected to result in substantial reorganization of host cell RNA metabolism. We identified 14 proteins that were predicted to interact with host RNAs or RNA binding proteins, based on published data for SARS-CoV and SARS-CoV-2. Here, we describe a series of affinity-tagged and codon-optimized expression constructs for each of these 14 proteins. Each viral gene was separately tagged at the N-terminus with Flag-His 8 , the C-terminus with His 8 -Flag, or left untagged. The resulting constructs were stably integrated into the HEK293 Flp-In TREx genome. Each viral gene was expressed under the control of an inducible Tet-On promoter, allowing expression levels to be tuned to match physiological conditions during infection. Expression time courses were successfully generated for most of the fusion proteins and quantified by western blot. A few fusion proteins were poorly expressed, whereas others, including Nsp1, Nsp12, and N protein, were toxic unless care was taken to minimize background expression. All plasmids can be obtained from Addgene and cell lines are available. We anticipate that availability of these resources will facilitate a more detailed understanding of coronavirus molecular biology.

Transcription elongation is stochastic and driven by a Brownian ratchet mechanism, making it subject to changes in velocity. However, on regions occupied by multiple polymerases, notably the rDNA, DNA rotation plus torsion constrain polymerase molecules to proceed at the same rate generating "torsional entrainment". We report that release of entrainment, by co-transcriptional 39- end cleavage, is permissive for relative movement between polymerases, promoting pausing and backtracking. Subsequent termination (polymerase release) is facilitated by the 59-exonuclease Rat1 (Xrn2) and backtracked transcript cleavage by RNAPI subunit Rpa12. These activities were reproduced in vitro. Short nascent transcripts close to the transcriptional start site, combined with nascent transcript folding energy, similarly facilitate RNAPI pausing. Nascent, backtracked transcripts at pause sites, are targeted by both the exosome cofactor TRAMP and Rat1, promoting termination. Topoisomerase 2 localizes adjacent to RNAPI pause sites, potentially allowing continued elongation by downstream polymerases. Biophysical modeling supported substantial (~10%) premature termination.

Abstract In the snoRNA host gene SNHG14 , 29 consecutive introns each generate SNORD116, and 48 tandem introns encode SNORD115. Loss of SNORD116 expression, but not of SNORD115, is linked to the neurodevelopmental disease Prader-Willi syndrome. SNORD116 and SNORD115 resemble box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) but lack known targets. Both were strongly accumulated during neuronal differentiation, but with distinct mechanisms: Increased host-gene expression for SNORD115 and apparent stabilization for SNORD116. For functional characterization we created cell lines specifically lacking the expressed, paternally inherited, SNORD115 or SNORD116 cluster. Analyses during neuronal development indicates changes in RNA stability and protein synthesis. These data suggest that the loss of SNORD116 enhances some aspects of developmental timing of neuronal cells. Altered mRNAs include MAGEL2 , causal in the PWS-like disorder Schaaf-Yang syndrome. Comparison of SNORD115 and SNORD116 mutants identifies small numbers of altered mRNAs and ncRNAs. These are enriched for functions potentially linked to PWS phenotypes and include protocadherins, which are key cell signalling factors during neurodevelopment.

ABSTRACT Prader-Willi syndrome shows features linked to brain development and hypothalamus-related endocrine abnormalities. The smallest clinical deletions fall within the large (∼650Kb) SNHG14 gene, removing 29 consecutive introns that each generate SNORD116. SNHG14 also includes 48 tandem introns encoding SNORD115 and generates multiple, extended snoRNA-related species. SNORD115 and SNORD116 resemble box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) but lack known targets. Both snoRNAs strongly accumulated during neuronal differentiation. SNORD116 accumulation apparently reflected stabilization, potentially linked to the appearance of FBLL1, a homologue of the ubiquitous snoRNA-associated protein Fibrillarin (FBL). In contrast, SNORD115 was selectively transcribed, apparently due to regulated termination. For functional characterization we created cell lines lacking only the expressed, paternal, SNORD115 or SNORD116 cluster. Analyses during neuronal development indicated changes in RNA stability and protein synthesis. Altered mRNAs included MAGEL2 , mutation of which causes the PWS-like disorder Schaaf-Yang syndrome. Comparison of SNORD115 and SNORD116 mutants indicated overlapping or interacting functions. Most changes in mRNA and protein abundance appeared relatively late in development, with roles including cytoskeleton formation, extracellular matrix, neuronal arborization. Comparison with human embryonic midbrain development suggested enhanced progression in neuronal development in the snoRNA mutants. Subtle impairment of relative neuronal maturation during development, might generate the clinical phenotypes.

Transcription elongation rates are important for RNA processing, but sequence-specific regulation is poorly understood. We addressed this in vivo, analyzing RNAPI in S.cerevisiae. Analysis of Miller chromatin spreads and mapping RNAPI using UV crosslinking, revealed a marked 5' bias and strikingly uneven local polymerase occupancy, indicating substantial variation in transcription speed. Two features of the nascent transcript correlated with RNAPI distribution; folding energy and G+C content. In vitro experiments confirmed that strong RNA structures close to the polymerase promote forward translocation and limit backtracking, whereas high G+C within the transcription bubble slows elongation. We developed a mathematical model for RNAPI elongation, which confirmed the importance of nascent RNA folding in transcription. RNAPI from S.pombe was similarly sensitive to transcript folding, as were S.cerevisiae RNAPII and RNAPIII. For RNAPII, unstructured RNA, which favors slowed elongation, was associated with faster cotranscriptional splicing and proximal splice site usage indicating regulatory significance for transcript folding.