Breast cancer is a heterogeneous disease. Tumor cells and associated healthy cells form ecosystems that determine disease progression and response to therapy. To characterize features of breast cancer ecosystems and their associations with clinical data, we analyzed 144 human breast tumor and 50 non-tumor tissue samples using mass cytometry. The expression of 73 proteins in 26 million cells was evaluated using tumor and immune cell-centric antibody panels. Tumors displayed individuality in tumor cell composition, including phenotypic abnormalities and phenotype dominance. Relationship analyses between tumor and immune cells revealed characteristics of ecosystems related to immunosuppression and poor prognosis. High frequencies of PD-L1+ tumor-associated macrophages and exhausted T cells were found in high-grade ER+ and ER− tumors. This large-scale, single-cell atlas deepens our understanding of breast tumor ecosystems and suggests that ecosystem-based patient classification will facilitate identification of individuals for precision medicine approaches targeting the tumor and its immunoenvironment.

Abstract Many different solutions to predicting the cognate epitope target of a T-cell receptor (TCR) have been proposed. However several questions on the advantages and disadvantages of these different approaches remain unresolved, as most methods have only been evaluated within the context of their initial publications and data sets. Here, we report the findings of the first public TCR-epitope prediction benchmark performed on 23 prediction models in the context of the ImmRep 2022 TCR-epitope specificity workshop. This benchmark revealed that the use of paired-chain alpha-beta, as well as CDR1/2 or V/J information, when available, improves classification obtained with CDR3 data, independent of the underlying approach. In addition, we found that straight-forward distance-based approaches can achieve a respectable performance when compared to more complex machine-learning models. Finally, we highlight the need for a truly independent follow-up benchmark and provide recommendations for the design of such a next benchmark.

High-throughput "omics" data, including genomic, transcriptomic, and epigenetic data, have become increasingly produced and have contributed in recent years to the advances in cancer research. In particular, multimodal omics data get now employed in addition to clinical data to stratify patients according to their clinical outcomes. Despite some recent work on benchmarking multi-modal integration strategies for cancer survival prediction, there is still a need for the standardization of the results of model performances and for the consecutive exploration of the relative performance of statistical and deep learning models. Here, we propose a unique benchmark, SurvBoard, which standardizes several important experimental design choices to enable comparability between cancer survival models that incorporate multi-omics data. By designing several benchmarking scenarios, SurvBoard allows for the comparison of single-cancer models and models trained on pan-cancer data; SurvBoard also makes it possible to investigate the added value of using patient data with missing modalities. Additionally, in this work, we point out several potential pitfalls that might arise during the preprocessing and validation of multi-omics cancer survival models and address them in our benchmark. We compare statistical and deep learning models revealing that statistical models often outperform deep learning models, particularly in terms of model calibration. Finally, we offer a web service that enables quick model evaluation against our benchmark (https://www.survboard.science/). All code and other resources are available on GitHub: https://github.com/BoevaLab/survboard/.

Abstract Germinal centers (GCs) are specialized compartments within the secondary lymphoid organs where B cells proliferate, differentiate, and mutate their antibody genes in response to the presence of foreign antigens. They play a central role in generating an effective immune response against infectious pathogens, and failures in their regulating mechanisms can lead to the development of autoimmune diseases and cancer. While previous works study experimental systems of the immune response with mouse models that are immunized with specific antigens, our study focuses on a real life situation, with an ongoing GC response in a human lymph node (LN) involving multiple asynchronized GCs reacting simultaneously to unknown antigens. We combined laser capture microdissection (LCM) of individual GCs from human LN with next-generation repertoire sequencing (Rep-seq) to characterize individual GCs as distinct evolutionary spaces. In line with well-characterized GC responses in mice, elicited by immunization with model antigens such as NP-CGG, we observe a relatively low sequence similarity, as well as heterogeneous clonal diversity across individual GCs from the same human LN. Still, we identify shared clones in several individual GCs, and phylogenetic tree analysis combined with paratope modeling suggest the re-engagement and rediversification of B-cell clones across GCs as well as expanded clones exhibiting shared antigen responses across distinct GCs, indicating convergent evolution of the GCs. Finally, our study allows for the characterization of non-functional clones, where frequencies of V(D)J or SHM induced stop codons are quantified.

Abstract The adaptive immune system has the extraordinary ability to produce a broad range of immunoglobulins that can bind a wide variety of antigens. During adaptive immune responses, activated B cells duplicate and undergo somatic hypermutation in their B-cell receptor (BCR) genes, resulting in clonal families of diversified B-cells that can be related back to a common ancestor. Advances in high-throughput sequencing technologies have enabled the high-throughput characterization of B-cell repertoires, however, the accurate identification of clonally related BCR sequences remains a major challenge. In this study, we compare three different clone identification methods on both simulated and experimental data, and investigate their impact on the characterization of B-cell diversity. We find that different methods may lead to different clonal definitions, which in turn can affect the quantification of clonal diversity in repertoire data. Interestingly, we find the Shannon entropy to be overall the most robust diversity index in regard to different clonal identification. Our analysis also suggests that the traditional germline gene alignment-based method for clonal identification remains the most accurate when the complete information about the sequence is known, but that alignment-free methods may be preferred for shorter read length. We make our implementation freely available as a Python library cdiversity .

RNA-sequencing and differential gene expression studies have significantly advanced our understanding of pathogenic pathways underlying Rheumatoid Arthritis (RA). Yet, little is known about cell-specific regulatory networks and their contributions to disease. In this study, we focused on fibroblast-like synoviocytes (FLS), a cell type central to disease pathogenesis and joint damage in RA. We used a strategy that computed sample-specific gene regulatory networks (GRNs) to compare network properties between RA and osteoarthritis FLS. We identified 28 transcription factors (TFs) as key regulators central to the signatures of RA FLS. Six of these TFs are new and have not been previously implicated in RA, and included BACH1, HLX, and TGIF1. Several of these TFs were found to be co-regulated, and BACH1 emerged as the most significant TF and regulator. The main BACH1 targets included those implicated in fatty acid metabolism and ferroptosis. The discovery of BACH1 was validated in experiments with RA FLS. Knockdown of BACH1 in RA FLS significantly affected the gene expression signatures, reduced cell adhesion and mobility, interfered with the formation of thick actin fibers, and prevented the polarized formation of lamellipodia, all required for the RA destructive behavior of FLS. This is the first time that BACH1 is shown to have a central role in the regulation of FLS phenotypes, and gene expression signatures, as well as in ferroptosis and fatty acid metabolism. These new discoveries have the potential to become new targets for treatments aimed at selectively targeting the RA FLS.

ABSTRACT Chimeric antigen receptor (CAR) T cells represent a promising approach for cancer treatment, yet challenges remain such as limited efficacy due to a lack of T cell persistence. Given its critical role in promoting and modulating T cell responses, it is crucial to understand how alterations in the CAR signaling architecture influence T cell function. Here, we designed a combinatorial CAR signaling domain library and performed repeated antigen stimulation assays, pooled screening and single-cell sequencing to investigate T-cell responses triggered by different CAR architectures. Parallel comparisons of CAR variants, at early, middle and late timepoints during chronic antigen stimulation systematically assessed the impact of modifying signaling domains on T cell activation and persistence. Our data reveal the predominant influence of membrane-proximal domains in driving T cell phenotype. Additionally, we highlight the critical role of CD40 costimulation in promoting potent and persistent T cell responses, followed by CTLA4, which induces a long-term cytotoxic phenotype. This work deepens the understanding of CAR T cell biology and may be used to guide the future engineering of CAR T cell therapies.

Rheumatoid arthritis (RA) is a common autoimmune and inflammatory disease characterized by inflammation and hyperplasia of the synovial tissues. RA pathogenesis involves multiple cell types, genes, transcription factors (TFs) and networks. Yet, little is known about the TFs, and key drivers and networks regulating cell function and disease at the synovial tissue level, which is the site of disease. In the present study, we used available RNA-seq databases generated from synovial tissues and developed a novel approach to elucidate cell type-specific regulatory networks on synovial tissue genes in RA. We leverage established computational methodologies to infer sample-specific gene regulatory networks and applied statistical methods to compare network properties across phenotypic groups (RA versus osteoarthritis). We developed computational approaches to rank TFs based on their contribution to the observed phenotypic differences between RA and controls across different cell types. We identified 18,16,19,11 key regulators of fibroblast-like synoviocyte (FLS), T cells, B cells, and monocyte signatures and networks, respectively, in RA synovial tissues. Interestingly, FLS and B cells were driven by multiple independent co-regulatory TF clusters that included MITF, HLX, BACH1 (FLS) and KLF13, FOSB, FOSL1 (synovial B cells). However, monocytes were collectively governed by a single cluster of TF drivers, responsible for the main phenotypic differences between RA and controls, which included RFX5, IRF9, CREB5. Among several cell subset and pathway changes, we also detected reduced presence of NKT cell and eosinophils in RA synovial tissues. Overall, our novel approach identified new and previously unsuspected KDG, TF and networks and should help better understanding individual cell regulation and co-regulatory networks in RA pathogenesis, as well as potentially generate new targets for treatment.

ABSTRACT Gleason grading is an important prognostic indicator for prostate adenocarcinoma and is crucial for patient treatment decisions. However, intermediate-risk patients diagnosed in Gleason Grade Groups (GG) 2 and GG3 can harbour either aggressive or non-aggressive disease, resulting in under- or over-treatment of a significant number of patients. Here, we performed proteomic, differential expression, machine learning, and survival analyses for 1,348 matched tumour and benign sample runs from 278 patients. Three proteins (F5, TMEM126B and EARS2) were identified as candidate biomarkers in patients with biochemical recurrence. Multivariate Cox regression yielded 18 proteins, from which a risk score was constructed to dichotomise prostate cancer patients into low- and high-risk groups. This 18-protein signature is prognostic for the risk of biochemical recurrence and completely independent of the intermediate GG. Our results suggest that markers generated by computational proteomic profiling have the potential for clinical applications including integration into prostate cancer management.

Germinal centers (GCs) are the key histological structures of the adaptive immune system, responsible for the development and selection of B cells producing high-affinity antibodies against antigens. Due to their level of complexity, unexpected malfunctioning may lead to a range of pathologies, including various malignant formations. One promising way to improve the understanding of malignant transformation is to study the underlying gene regulatory networks (GRNs) associated with cell development and differentiation. Evaluation and inference of the GRN structure from gene expression data is a challenging task in systems biology: recent achievements in single-cell (SC) transcriptomics allow the generation of SC gene expression data, which can be used to sharpen the knowledge on GRN structure. In order to understand whether a particular network of three key gene regulators (BCL6, IRF4, BLIMP1), influenced by two external stimuli signals (surface receptors BCR and CD40), is able to describe GC B cell differentiation, we used a stochastic model to fit SC transcriptomic data from a human lymphoid organ dataset. The model is defined mathematically as a piecewise-deterministic Markov process. We showed that after parameter tuning, the model qualitatively recapitulates mRNA distributions corresponding to GC and plasmablast stages of B cell differentiation. Thus, the model can assist in validating the GRN structure and, in the future, could lead to better understanding of the different types of dysfunction of the regulatory mechanisms.