The ability to visualize in real‐time the expression level and localization of specific endogenous RNAs in living cells can offer tremendous opportunities for biological and disease studies. Here we demonstrate such a capability using a pair of molecular beacons, one with a donor and the other with an acceptor fluorophore that hybridize to adjacent regions on the same mRNA target, resulting in fluorescence resonance energy transfer (FRET). Detection of the FRET signal significantly reduced false positives, leading to sensitive imaging of K‐ras and survivin mRNAs in live HDF and MIAPaCa‐2 cells. FRET detection gave a ratio of 2.25 of K‐ras mRNA expression in stimulated and unstimulated HDF, comparable to the ratio of 1.95 using RT–PCR, and in contrast to the single‐beacon result of 1.2. We further revealed intriguing details of K‐ras and survivin mRNA localization in living cells. The dual FRET molecular beacons approach provides a novel technique for sensitive RNA detection and quantification in living cells.

Significance Nanoparticle-mediated delivery of siRNA to hepatocytes has treated disease in humans. However, systemically delivering RNA drugs to nonliver tissues remains an important challenge. To increase the number of nanoparticles that could be studied in vivo, we designed a high-throughput method to measure how >100 nanoparticles delivered mRNA that was translated into functional protein in vivo. We quantified how >250 lipid nanoparticles (LNPs) delivered mRNA in vivo, identifying two LNPs that deliver mRNA to endothelial cells. One of the LNPs codelivered Cas9 mRNA and single-guide RNA in vivo, leading to endothelial cell gene editing. This approach can identify nanoparticles that target new cells.

Antibodies sustain viral control For many infected individuals, antiretroviral therapy (ART) means that an HIV-1 diagnosis is no longer a death sentence. But the virus persists in treated individuals, and complying with the intense drug regimen to keep virus loads down can be challenging for patients. Seeking an alternative, Byrareddy et al. treated ART-suppressed monkeys with antibodies targeting α4β7 integrin. When ART was halted in the antibody-treated animals, viral loads stayed undetectable, and normal CD4 T cell counts were maintained for over 9 months—and persisted—even after stopping the antibody therapy. Science , this issue p. 197

Abstract The emergence of the CRISPR-Cas system as a technology has transformed our ability to modify nucleic acids. Prokaryotes evolved one member of this family, CRISPR-Cas effector, Cas13a, as an RNA-guided ribonuclease that protects them from invading bacteriophages. Here, we demonstrate that Cas13a can be programmed to target eukaryotic viral pathogens, influenza virus A (IVA) and human respiratory syncytial virus (hRSV) in human cells. We designed synthetic mRNA coding for Cas13a, which when guided by CRISPR RNAs (crRNA) to target influenza virus or hRSV RNA, significantly mitigates these infections both prophylactically, therapeutically, and over time. These data demonstrate a possible new class of synthetic mRNA-powered anti-viral interventions. One Sentence Summary crRNA guided Cas13a halts RNA virus infections

Abstract Respiratory syncytial virus (RSV) is a leading cause of respiratory disease in infants and the elderly. In common with most viruses that replicate in the host cell cytoplasm, RSV induces the formation of cytoplasmic compartments within infected cells to sequester replicative processes from host countermeasures. The best characterised organelle formed during RSV infection is the inclusion body – the primary site of viral RNA synthesis - thought to form as a membrane-less biomolecular condensate. Fluorescence microscopy of cellular compartments using probes directed at the structural proteins of RSV and the intergenic regions of the RSV genome have identified a second class of organelles termed assembly granules. Here we use correlative microscopy to identify assembly granules in the cytoplasm of frozen hydrated RSV infected cells for imaging using cryogenic soft X-ray tomography and cryogenic electron tomography. We show that these compartments are membrane bound, enclosing large numbers of vesicles, some of which contain RSV ribonucleoprotein complexes. Further we show that these organelles are frequently adjacent to mitochondria and surrounded by ER-like membranes. We also observe vesicles connected by junctions suggesting mixing of contents and a mechanism for the different viral proteins to come together within the assembly granule prior to budding. Collectively, our data provides novel insights into the RSV assembly process.

ABSTRACT Here, Cas13a has been used to target and mitigate influenza virus A (IAV) and SARS-CoV-2 using a synthetic mRNA-based platform. CRISPR RNAs (crRNA) against PB1 and highly conserved regions of PB2 were screened in conjunction with mRNA-encoded Cas13a. Screens were designed such that only guides that decreased influenza RNA levels in a Cas13-mediated fashion, were valid. Cas13a mRNA and validated guides, delivered post-infection, simulating treatment, were tested in combination and across multiplicities of infection. Their function was also characterized over time. Similar screens were performed for guides against SARS-CoV-2, yielding multiple guides that significantly impacted cytopathic effect. Last, the approach was utilized in vivo , demonstrating the ability to degrade influenza RNA in a mouse model of infection, using polymer-formulated, nebulizer-based mRNA delivery. Our findings demonstrate the applicability of Cas13a in mitigating respiratory infections both in vitro and in a mouse model, paving the way for future therapeutic use.

Abstract CAR T cell immunotherapy relies on CAR targeting of tumor-associated antigens, yet heterogenous antigen expression, interpatient variation, and off-tumor expression by healthy cells remain barriers. Here, we develop synthetic antigens to sensitize solid tumors for recognition and elimination by CAR T cells. Unlike tumor-associated antigens, we design synthetic antigens that are orthogonal to endogenous proteins to eliminate off-tumor targeting and that have a small genetic footprint to facilitate efficient tumor delivery to tumors by viral vectors. Using the RSV-F camelid single-domain antibody (VHH) as a synthetic antigen, we show that adoptive transfer of αVHH CAR T cells to mice bearing VHH expressing tumors reduced tumor burden in multiple syngeneic mouse models of cancer, improved survival, induced epitope spread, and protected against tumor rechallenge. Our work supports in situ delivery of synthetic antigens to treat antigen low or negative tumors with CAR T cells.

Abstract Elevated levels of TGF-β, a potent immunosuppressive factor, are present in HIV-1 infected individuals even after years of antiretroviral therapy (ART). TGF-β plays a critical role in maintaining immune cells in a resting state by inhibiting cell activation and proliferation. Resting HIV-1 target cells represent one of the main cellular reservoirs after long term ART and the low inducibility of the latent provirus constitutes one of the major obstacles to “kick and kill” cure strategies. We hypothesized that releasing cells from TGF-β-driven signaling would promote latency reversal. To test our hypothesis, we compared ex vivo models of HIV-1 latency reactivation with and without TGF-β and a TGF-β type 1 receptor (TGFBR1) inhibitor, galunisertib. We also tested the effect of galunisertib in SIV infected, ART treated macaques by monitoring SIV envelope (env) protein expression via PET/CT using the Cu 64 -anti gp120 Fab (7D3) probe, along with plasma and tissue viral loads (VL). Exogenous TGF-1β reduced HIV-1 reactivation in U1 and ACH2 latency models. Galunisertib increased HIV-1 latency reversal both in ex vivo models and in PBMC from HIV-1 infected, cART treated aviremic donors. In vivo , oral galunisertib promoted increased SIV env protein total standardized uptake values (SUVtot) in PET/CT images of tissues (gut and lymph nodes) of 5 out of 7 aviremic, long-term ART-treated, SIV-infected, macaques. This increase correlated with an increase in SIV RNA in gut tissue. Two out of 7 animals also exhibited increases in plasma viral load. Higher anti-SIV T cell responses and anti-SIV env antibody titers were detected after galunisertib treatment in most animals. In summary, our data suggest that blocking TGF-β signaling simultaneously increases retroviral reactivation events and enhances anti-SIV immune responses.