Many patients experiencing sudden loss of lung tissue somehow undergo full recovery; here this recovery is traced to a discrete population of lung stem cells that are not only essential for lung regeneration but can be cloned and then transplanted to other mice to contribute new lung tissue. The extent to which patients can recover after massive loss of lung tissue has been unclear. However, clinical experience has shown that large-scale lung regeneration can occur in children and adults following catastrophic lung damage, and previous studies in mice have linked a subset of cells from distal airway to a regeneration process observed after H1N1 influenza virus mediated injury. Two papers published in this issue show that when the epithelial cells lining the interior of the lung are damaged, a rare stem cell population is induced to proliferate and migrate to the damaged site where they differentiate into several cell types. Frank McKeon and colleagues describe a rare subset of mouse distal airway cells that proliferate after exposure to influenza. These cells can contribute to lung regeneration after transplantation and maintain their intrinsic lineage commitment in cell culture, suggesting that such cell subsets may have potential in stem-cell-based therapies. Harold Chapman and colleagues used lineage tracing to identify a population of quiescent cells in the mouse distal lung that are activated after bleomycin or influenza-mediated injury. These cells express cytokeratin 5 and repair the epithelium through a Notch signalling pathway, although persistent Notch signalling in this context then leads to the formation of cysts. Data from patients suffering from lung fibrosis also show the presence of hyperactive Notch and similar cysts. Lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease1 and pulmonary fibrosis2 involve the progressive and inexorable destruction of oxygen exchange surfaces and airways, and have emerged as a leading cause of death worldwide. Mitigating therapies, aside from impractical organ transplantation, remain limited and the possibility of regenerative medicine has lacked empirical support. However, it is clinically known that patients who survive sudden, massive loss of lung tissue from necrotizing pneumonia3,4 or acute respiratory distress syndrome5,6 often recover full pulmonary function within six months. Correspondingly, we recently demonstrated lung regeneration in mice following H1N1 influenza virus infection, and linked distal airway stem cells expressing Trp63 (p63) and keratin 5, called DASCp63/Krt5, to this process7. Here we show that pre-existing, intrinsically committed DASCp63/Krt5 undergo a proliferative expansion in response to influenza-induced lung damage, and assemble into nascent alveoli at sites of interstitial lung inflammation. We also show that the selective ablation of DASCp63/Krt5 in vivo prevents this regeneration, leading to pre-fibrotic lesions and deficient oxygen exchange. Finally, we demonstrate that single DASCp63/Krt5-derived pedigrees differentiate to type I and type II pneumocytes as well as bronchiolar secretory cells following transplantation to infected lung and also minimize the structural consequences of endogenous stem cell loss on this process. The ability to propagate these cells in culture while maintaining their intrinsic lineage commitment suggests their potential in stem cell-based therapies for acute and chronic lung diseases.

Fluorescence nanoscopy, or super-resolution microscopy, has become an important tool in cell biological research. However, because of its usually inferior resolution in the depth direction (50–80 nm) and rapidly deteriorating resolution in thick samples, its practical biological application has been effectively limited to two dimensions and thin samples. Here, we present the development of whole-cell 4Pi single-molecule switching nanoscopy (W-4PiSMSN), an optical nanoscope that allows imaging of three-dimensional (3D) structures at 10- to 20-nm resolution throughout entire mammalian cells. We demonstrate the wide applicability of W-4PiSMSN across diverse research fields by imaging complex molecular architectures ranging from bacteriophages to nuclear pores, cilia, and synaptonemal complexes in large 3D cellular volumes.

Abstract Somatic mutations in splicing factors are of significant interest in myeloid malignancies and other cancers. U2AF1, together with U2AF2, is essential for 3’ splice site recognition. U2AF1 mutations result in aberrant splicing, but the molecular mechanism and the full spectrum of consequences on RNA biology have not been fully elucidated to date. We performed multi-omics profiling of in vivo RNA binding, splicing and turnover for U2AF1 S34F and Q157R mutants. We dissected specific binding signals of U2AF1 and U2AF2 and showed that U2AF1 mutations individually alter U2AF1-RNA binding, resulting in defective U2AF2 recruitment. We demonstrated a complex relationship between differential binding and splicing, expanding upon the currently accepted loss-of-binding model. Finally, we observed that U2AF1 mutations increase the formation of stress granules in both cell lines and primary acute myeloid leukemia samples. Our results uncover U2AF1 mutation-dependent pathogenic RNA mechanisms and provide the basis for developing targeted therapeutic strategies.

Understanding cellular organization demands the best possible spatial resolution in all three dimensions (3D). In fluorescence microscopy, this is achieved by 4Pi nanoscopy methods that combine the concepts of using two opposing objectives for optimal diffraction-limited 3D resolution with switching fluorescent molecules between bright and dark states to break the diffraction limit. However, optical aberrations have limited these nanoscopes to thin samples and prevented their application in thick specimens. Here, we have developed a nanoscope that, by utilizing an advanced adaptive optics strategy, achieves sub-50 nm isotropic resolution of structures such as neuronal synapses and ring canals previously inaccessible in tissue.

Diffraction-unlimited single-molecule switching (SMS) nanoscopy techniques like STORM /(F)PALM enable three-dimensional (3D) fluorescence imaging at 20-80 nm resolution and are invaluable to investigate sub-cellular organization. They suffer, however, from low throughput, limiting the output of a days worth of imaging to typically a few tens of mammalian cells. Here we develop an SMS imaging platform that combines high-speed 3D single-molecule data acquisition with an automated, fully integrated, high-volume data processing pipeline. We demonstrate 2-color 3D super-resolution imaging of over 10,000 mammalian cell nuclei in about 26 hours, connecting the traditionally low-throughput super-resolution community to the world of omics approaches.

Combining the molecular specificity of fluorescent probes with three-dimensional (3D) imaging at nanoscale resolution is critical for investigating the spatial organization and interactions of cellular organelles and protein complexes. We present a super-resolution light microscope that enables simultaneous multicolor imaging of whole mammalian cells at ~20 nm 3D resolution. We show its power for cell biology research with fluorescence images that resolved the highly convoluted Golgi apparatus and the close contacts between the endoplasmic reticulum and the plasma membrane, structures that have traditionally been the imaging realm of electron microscopy.