The RNA-binding protein CsrA (carbon storage regulator) is a new kind of global regulator, which facilitates specific mRNA decay. A recombinant CsrA protein containing a metal-binding affinity tag (CsrA-H6) was purified to homogeneity and authenticated by N-terminal sequencing, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, and other studies. This protein was entirely contained within a globular complex of approximately 18 CsrA-H6 subunits and a single approximately 350-nucleotide RNA, CsrB. cDNA cloning and nucleotide sequencing revealed that the csrB gene is located downstream from syd in the 64-min region of the Escherichia coli K-12 genome and contains no open reading frames. The purified CsrA-CsrB ribonucleoprotein complex was active in regulating glg (glycogen biosynthesis) gene expression in vitro, as was the RNA-free form of the CsrA protein. Overexpression of csrB enhanced glycogen accumulation in E. coli, a stationary phase process that is repressed by CsrA. Thus, CsrB RNA is a second component of the Csr system, which binds to CsrA and antagonizes its effects on gene expression. A model for regulatory interactions in Csr is presented, which also explains previous observations on the homologous system in Erwinia carotovora. A highly repeated nucleotide sequence located within predicted stem-loops and other single-stranded regions of CsrB, CAGGA(U/A/C)G, is a plausible CsrA-binding element.

MarR (multiple antibiotic resistance repressor) family proteins are bacterial repressors that regulate transcription in response to a wide range of chemical signals. Although specific features of MarR family function have been described, the role of atomic motions in MarRs remains unexplored thus limiting insights into the evolution of allostery in this ubiquitous family of repressors. Here, we provide the first experimental evidence that internal dynamics play a crucial functional role in MarR proteins. Streptococcus pneumoniae AdcR (adhesin-competence repressor) regulates ZnII homeostasis and ZnII functions as an allosteric activator of DNA binding. ZnII coordination triggers a transition from independent domains to a more compact structure. We identify residues that impact allosteric activation on the basis of ZnII-induced perturbations of atomic motions over a wide range of timescales. These findings reconcile the distinct allosteric mechanisms proposed for other MarRs and highlight the importance of conformational dynamics in biological regulation.

Streptococcus pneumoniae is a leading killer of infants and immunocompromised adults and has become increasingly resistant to major antibiotics. Therefore, the development of new antibiotic strategies is desperately needed. Targeting bacterial cell division is one such strategy, specifically targeting essential proteins for the synthesis and breakdown of peptidoglycan. One complex important to this process is FtsEX. FtsEX comprises an integral membrane protein (FtsX) and cytoplasmic ATPase (FtsE) that resembles an ATP-binding cassette (ABC) transporter. Here, we present NMR solution structural and crystallographic models of the large extracellular domain of FtsX, denoted ECL1. The structure of ECL1 reveals an upper extended β-hairpin and a lower α-helical lobe, each extending from a mixed α-β core. The helical lobe mediates a physical interaction with the peptidoglycan hydrolase PcsB, via the coiled-coil domain of PcsB (PcsB-CC). Characterization of S. pneumoniae D39 derived strains harboring mutations in the α-helical lobe shows that this subdomain is essential for cell viability and required for proper cell division of S. pneumoniae.

Cysteine thiol-based transcriptional regulators orchestrate coordinated regulation of redox homeostasis and other cellular processes by sensing or detecting a specific redox-active molecule, which in turn activates the transcription of a specific detoxification pathway. The extent to which these sensors are truly specific in cells for a singular class of reactive small molecule stressors, e.g., reactive oxygen or sulfur species, is largely unknown. Here we report novel structural and mechanistic insights into a thiol-based transcriptional repressor SqrR, that reacts exclusively with organic and inorganic oxidized sulfur species, e.g., persulfides, to yield a unique tetrasulfide bridge that allosterically inhibits DNA operator-promoter binding. Evaluation of five crystallographic structures of SqrR in various derivatized states, coupled with the results of a mass spectrometry-based kinetic profiling strategy, suggests that persulfide selectivity is determined by structural frustration of the disulfide form. This energetic roadblock effectively decreases the reactivity toward major oxidants to kinetically favor the formation of the tetrasulfide product. These findings lead to the identification of an uncharacterized repressor from the increasingly antibiotic-resistant bacterial pathogen, Acinetobacter baumannii, as a persulfide sensor, illustrating the predictive power of this work and potential applications to bacterial infectious disease.

Zinc is a vital transition metal for Streptococcus pneumoniae, but is deadly at high concentrations. Zn intoxication of S. pneumoniae results from a deficiency in Mn, which is required for key metabolic enzymes and defense against oxidative stress. Here, we report our identification and characterization of the function of the five homologous, CiaRH-regulated Ccn sRNAs in controlling S. pneumoniae virulence and metal homeostasis. We show that deletion of all five ccn genes (ccnA, ccnB, ccnC, ccnD, and ccnE) from S. pneumoniae strains D39 (serotype 2) and TIGR4 (serotype 4) causes Zn hypersensitivity and an attenuation of virulence in a murine invasive pneumonia model. We provide evidence that addition of Zn disproportionately impairs Mn uptake by the ΔccnABCDE mutants. Consistent with a response to Mn starvation, expression of genes encoding the CzcD Zn exporter and the Mn-independent ribonucleotide reductase, NrdD-NrdG, were increased in the ΔccnABCDE mutant relative to its isogenic ccn+ parent strain. The growth inhibition by Zn that occurs as the result of loss of the ccn genes is rescued by supplementation with Mn or OxyraseTM, a reagent that removes dissolved oxygen. Lastly, we found that the Zn-dependent growth inhibition of the ΔccnABCDE strain was not altered by deletion of sodA, whereas the ccn+ ΔsodA strain phenocopied the ΔccnABCDE strain. Overall, our results indicate that the Ccn sRNAs have a crucial role in preventing oxidative stress in S. pneumoniae during exposure to excess Zn by modulating Mn uptake.

ABSTRACT Ergothioneine (ET) is the 2-thiourea derivative of trimethylhistidine that is biosynthesized only by select fungi and bacteria, notably Mycobacterium tuberculosis , and functions as a potent scavenger of reactive oxygen species. Although ET is obtained in the diet and accumulates in vertebrate cells via an ET-specific transporter, the extent to which ET broadly functions in bacterial cells unable to synthesize it is unknown. Here we show that spd_1642-1643 in Streptococcus pneumoniae D39, a Gram-positive respiratory pathogen, encodes a novel ergothioneine uptake ATP-binding cassette (ABC) transporter, which we designate EgtUV. EgtU is a permease-solute binding domain (SBD) fusion protein, and the SBD binds ET with high affinity and exquisite specificity in the cleft between the two subdomains, with cation-π interactions engaging the betaine moiety and a water-mediated hydrogen bonding network surrounding the C2-sulfur-containing imidazole ring. Bioinformatics studies reveal that EgtUV is uniquely strongly conserved among known quaternary amine-specific transporters and widely distributed in firmicutes, including the human pathogens Listeria monocytogenes , as BilEB, Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus . This discovery significantly diversifies the LMW thiol pool in Gram-positive human pathogens that may contribute to antioxidant defenses in the infected host.

The vertebrate host’s immune system and resident commensal bacteria deploy a range of highly reactive small molecules that provide a barrier against infections by microbial pathogens. Gut pathogens, such as Vibrio cholerae , sense and respond to these stressors by modulating the expression of exotoxins that are crucial for colonization. Here, we employ mass-spectrometry-based profiling, metabolomics, expression assays and biophysical approaches to show that transcriptional activation of the hemolysin gene hlyA in V. cholerae is regulated by intracellular reactive sulfur species (RSS), specifically sulfane sulfur. We first present a comprehensive sequence similarity network analysis of the arsenic repressor (ArsR) superfamily of transcriptional regulators where RSS and reactive oxygen species (ROS) sensors segregate into distinct clusters. We show that HlyU, transcriptional activator of hlyA in V. cholerae , belongs to the RSS-sensing cluster and readily reacts with organic persulfides, showing no reactivity and remaining DNA-bound following treatment with various ROS in vitro, including H 2 O 2 . Surprisingly, in V. cholerae cell cultures, both sulfide and peroxide treatment downregulate HlyU-dependent transcriptional activation of hlyA . However, RSS metabolite profiling shows that both sulfide and peroxide treatment raise the endogenous inorganic sulfide and disulfide levels to a similar extent, accounting for this crosstalk, and confirming that V. cholerae attenuates HlyU-mediated activation of hlyA in a specific response to intracellular RSS. These findings provide new evidence that gut pathogens may harness RSS-sensing as an evolutionary adaptation that allows them to overcome the gut inflammatory response by modulating the expression of exotoxins.

Abstract CstR is a persulfide-sensing member of the functionally diverse copper-sensitive operon repressor (CsoR) superfamily that regulates the bacterial response to hydrogen sulfide (H 2 S) and more oxidized reactive sulfur species (RSS) in Gram-positive pathogens. A cysteine thiol pair on CstR reacts with RSS to form a mixture of interprotomer di-, tri- and tetrasulfide crosslinks, which drives transcriptional derepression of CstR-regulated genes. In some bacteria, notably methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), CstR and CsoR, a Cu(I)-sensor, exhibit no regulatory crosstalk in cells, despite maintaining an identical pair of cysteines. We report a sequence similarity network (SSN) analysis of the entire CsoR superfamily, together with the first crystallographic structure of a CstR protein and mass spectrometry-based kinetic profiling experiments to obtain new insights into the molecular basis of RSS specificity in CstRs. The more N-terminal cysteine is the attacking Cys in CstR and is far more nucleophilic than in a CsoR. This cysteine, C30 in Sp CstR, is separated from the resolving thiol, C59’, by an Asn55’ wedge. Chemical reactivity experiments reveal a striking asymmetry of reactivity, preserved in all CstRs and with all oxidants tested; however, the distribution of crosslinked products varies markedly among CstRs. Substitution of N55 with Ala in Sp CstR significantly impacts the distribution of species, despite adopting the same structure as the parent repressor. We show that CstRs react with hydrogen peroxide, a finding that contrasts sharply with other structurally distinct persulfide sensors from Gram-negative bacteria. This suggests that other factors may enhance the specificity and repressor activity of CstRs in cells.

Synthetic biology has enabled the development of powerful nucleic acid diagnostic technologies for detecting pathogens and human health biomarkers. Here we expand the reach of synthetic biology-enabled diagnostics by developing a cell-free biosensing platform that uses RNA output sensors activated by ligand induction (ROSALIND) to detect harmful contaminants in aqueous samples. ROSALIND consists of three programmable components: highly-processive RNA polymerases, allosteric transcription factors, and synthetic DNA transcription templates. Together, these components allosterically regulate the in vitro transcription of a fluorescence-activating RNA aptamer: in the absence of a target compound, transcription is blocked, while in its presence a fluorescent signal is produced. We demonstrate that ROSALIND can be configured to detect a range of water contaminants, including antibiotics, toxic small molecules, and metals. Our cell-free biosensing platform, which can be freeze-dried for field deployment, creates a new capability for point-of-use monitoring of molecular species to address growing global crises in water quality and human health.