Abstract

 TRAF6 is a signal transducer in the NF-κB pathway that activates IκB kinase (IKK) in response to proinflammatory cytokines. We have purified a heterodimeric protein complex that links TRAF6 to IKK activation. Peptide mass fingerprinting analysis reveals that this complex is composed of the ubiquitin conjugating enzyme Ubc13 and the Ubc-like protein Uev1A. We find that TRAF6, a RING domain protein, functions together with Ubc13/Uev1A to catalyze the synthesis of unique polyubiquitin chains linked through lysine-63 (K63) of ubiquitin. Blockade of this polyubiquitin chain synthesis, but not inhibition of the proteasome, prevents the activation of IKK by TRAF6. These results unveil a new regulatory function for ubiquitin, in which IKK is activated through the assembly of K63-linked polyubiquitin chains.

The receptor interacting protein kinase 1 (RIP1) is essential for the activation of nuclear factor κB (NF-κB) by tumor necrosis factor α (TNFα). Here, we present evidence that TNFα induces the polyubiquitination of RIP1 at Lys-377 and that this polyubiquitination is required for the activation of IκB kinase (IKK) and NF-κB. A point mutation of RIP1 at Lys-377 (K377R) abolishes its polyubiquitination as well as its ability to restore IKK activation in a RIP1-deficient cell line. The K377R mutation of RIP1 also prevents the recruitment of TAK1 and IKK complexes to TNF receptor. Interestingly, polyubiquitinated RIP1 recruits IKK through the binding between the polyubiquitin chains and NEMO, a regulatory subunit of the IKK complex. Mutations of NEMO that disrupt its polyubiquitin binding also abolish IKK activation. These results reveal the biochemical mechanism underlying the essential signaling function of NEMO and provide direct evidence that signal-induced site-specific ubiquitination of RIP1 is required for IKK activation.

The activation of NF-κB and IKK requires an upstream kinase complex consisting of TAK1 and adaptor proteins such as TAB1, TAB2, or TAB3. TAK1 is in turn activated by TRAF6, a RING domain ubiquitin ligase that facilitates the synthesis of lysine 63-linked polyubiquitin chains. Here we present evidence that TAB2 and TAB3 are receptors that bind preferentially to lysine 63-linked polyubiquitin chains through a highly conserved zinc finger (ZnF) domain. Mutations of the ZnF domain abolish the ability of TAB2 and TAB3 to bind polyubiquitin chains, as well as their ability to activate TAK1 and IKK. Significantly, replacement of the ZnF domain with a heterologous ubiquitin binding domain restored the ability of TAB2 and TAB3 to activate TAK1 and IKK. We also show that TAB2 binds to polyubiquitinated RIP following TNFα stimulation. These results indicate that polyubiquitin binding domains represent a new class of signaling domains that regulate protein kinase activity through a nonproteolytic mechanism.

Abstract

 The CARD domain protein BCL10 and paracaspase MALT1 are essential for the activation of IκB kinase (IKK) and NF-κB in response to T cell receptor (TCR) stimulation. Here we present evidence that TRAF6 ubiquitin ligase and TAK1 protein kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1. RNAi-mediated silencing of MALT1, TAK1, TRAF6, and TRAF2 suppressed TCR-dependent IKK activation and interleukin-2 production in T cells. Furthermore, we have reconstituted the pathway from BCL10 to IKK activation in vitro with purified proteins of MALT1, TRAF6, TAK1, and ubiquitination enzymes including Ubc13/Uev1A. We find that a small fraction of BCL10 and MALT1 proteins form high molecular weight oligomers. Strikingly, only these oligomeric forms of BCL10 and MALT1 can activate IKK in vitro. The MALT1 oligomers bind to TRAF6, induce TRAF6 oligomerization, and activate the ligase activity of TRAF6 to polyubiquitinate NEMO. These results reveal an oligomerization → ubiquitination → phosphorylation cascade that culminates in NF-κB activation in T lymphocytes.

Abstract Background Analyses that use genome assemblies are critically affected by the contiguity, completeness, and accuracy of those assemblies. In recent years single-molecule sequencing techniques generating long-read information have become available and enabled substantial improvement in contig length and genome completeness, especially for large genomes (>100 Mb), although bioinformatic tools for these applications are still limited. Findings We developed a software tool to close sequence gaps in genome assemblies, TGS-GapCloser, that uses low-depth (~10×) long single-molecule reads. The algorithm extracts reads that bridge gap regions between 2 contigs within a scaffold, error corrects only the candidate reads, and assigns the best sequence data to each gap. As a demonstration, we used TGS-GapCloser to improve the scaftig NG50 value of 3 human genome assemblies by 24-fold on average with only ~10× coverage of Oxford Nanopore or Pacific Biosciences reads, covering with sequence data up to 94.8% gaps with 97.7% positive predictive value. These improved assemblies achieve 99.998% (Q46) single-base accuracy with final inserted sequences having 99.97% (Q35) accuracy, despite the high raw error rate of single-molecule reads, enabling high-quality downstream analyses, including up to a 31-fold increase in the scaftig NGA50 and up to 13.1% more complete BUSCO genes. Additionally, we show that even in ultra-large genome assemblies, such as the ginkgo (~12 Gb), TGS-GapCloser can cover 71.6% of gaps with sequence data. Conclusions TGS-GapCloser can close gaps in large genome assemblies using raw long reads quickly and cost-effectively. The final assemblies generated by TGS-GapCloser have improved contiguity and completeness while maintaining high accuracy. The software is available at https://github.com/BGI-Qingdao/TGS-GapCloser.

Abstract The completeness and accuracy of genome assemblies determine the quality of subsequent bioinformatics analysis. Despite benefiting from the medium/long-range information of third-generation sequencing techniques, current gap-closing tools to enhance assemblies suffer multi-alignments and high error rates, resulting in huge time and money costs. We developed a software tool, TGS-GapCloser that uses the low depth (>=10X) single molecule sequencing long reads without any error correction to close gaps. The algorithm distinguishes gap regions from the alignments of long reads against original scaffolds, corrects only the candidate regions, and assigns the best sequences to each gap. We demonstrate that TGS-GapCloser improves the contig N50 value of draft assembly by 25-fold on average, updating above 90% gaps with 93.96% positive predictive value. Despite of high error rate of raw long reads, improved assemblies archive Q50 (99.999%) single-base accuracy with only 11.8% decrement to inputs. Besides it could complete more gaps, and is also ∼29-fold faster than mainstream gap-closing tools. BUSCO analysis revealed that 3.4%-13.1% more expected genes were complete. TGS-GapCloser also shows its power to fill gaps for ultra large genome assembly of ginkgo (∼12Gb) with 71.6% of gaps closed. The validation of inserted or merged gap sequences was conducted with NGS reads and reference genomes, respectively. The updated genome assemblies may promote the gene annotation, structure variant calling and thus improving the downstream analysis of ontogeny, phylogeny, and evolution.

Abstract The monocot family Melanthiaceae with varying genome sizes in a range of 230-fold is an ideal model to study the genome size fluctuation in plants. Its family member Paris genus demonstrates an evolutionary trend of bearing huge genomes characterized by an average c-value of 49.22 pg. Here, we report a 70.18 Gb genome assembly out of the 82.55 Gb genome of Paris polyphylla var. yunnanensis (PPY), which represents the biggest sequenced genome to date. We annotate 69.53% repetitive sequences in this genome and 62.50% of which are long-terminal repeat (LTR) transposable elements. Further evolution analysis indicates that the giant genome likely results from the joint effect of common and species-specific expansion of different LTR superfamilies, which might contribute to the environment adaptation after speciation. Moreover, we identify the candidate pathway genes for the biogenesis of polyphyllins, the PPY-specific medicinal saponins, by complementary approaches including genome mining, comprehensive analysis of 31 next-generation RNA-seq data and 55.23 Gb single-molecule circular consensus sequencing (CCS) RNA-seq reads, and correlation of the transcriptome and phytochemical data of five different tissues at four growth stages. This study not only provides significant insights into plant genome size evolution, but also paves the way for the following polyphyllin synthetic biology.

ABSTRACT The accuracy and completeness of genome haplotyping are crucial for characterizing the relationship between human disease susceptibility and genetic variations, especially for the heterozygous variations. However, most of current variations are unphased genotypes, and the construction of long-range haplotypes remains challenging. We introduced a de novo haplotype-resolved assembly tool, HAST that exports two haplotypes of a diploid species for synthetic long reads with trio binning. It generates parental distinguishing k -mer libraries, partitions reads from the offspring according to the unique markers, and individually assembles them to resolve the haplotyping problem. Based on the stLFR co-barcoding data of an Asian as well as his parental massive parallel sequencing data, we utilized HAST to recover both haplotypes with a scaffold N50 of >11 Mb and an assembly accuracy of 99.99995% (Q63). The complete and accurate employment of long-range haplotyping information provided sub-chromosome level phase blocks (N50 ∼13 Mb) with 99.6% precision and 94.1% recall on average. We suggest that the accurate and efficient approach accomplishes the regeneration of the haplotype chromosomes with trio binning, thus promoting the determination of haplotype phase, the heterosis of crossbreeding, and the formation of autopolyploid and allopolyploid.