Abstract To study the effect of host genetics on gut microbiome composition, the MiBioGen consortium curated and analyzed genome-wide genotypes and 16S fecal microbiome data from 18,340 individuals (24 cohorts). Microbial composition showed high variability across cohorts: only 9 out of 410 genera were detected in more than 95% samples. A genome-wide association study (GWAS) of host genetic variation in relation to microbial taxa identified 31 loci affecting microbiome at a genome-wide significant (P<5×10 −8 ) threshold. One locus, the lactase ( LCT ) gene locus, reached study-wide significance (GWAS signal P=1.28×10 −20 ), and it showed an age-dependent association with Bifidobacterium abundance. Other associations were suggestive (1.95×10 −10 <P<5×10 −8 ) but enriched for taxa showing high heritability and for genes expressed in the intestine and brain. A phenome-wide association study and Mendelian randomization identified enrichment of microbiome trait loci in the metabolic, nutrition and environment domains and suggested the microbiome has causal effects in ulcerative colitis and rheumatoid arthritis.

Abstract The gut microbiome (GM) is shaped through infancy and plays a major role in determining susceptibility to chronic inflammatory diseases later in life. Bacteriophages (phages) are known to modulate bacterial populations in numerous ecosystems, including the gut. However, virome data is difficult to analyse because it mostly consists of unknown viruses, i.e. viral dark matter. Here, we manually resolved the viral dark matter in the largest human virome study published to date. Fecal viromes from a cohort of 647 infants at 1 year of age were deeply sequenced and analysed through successive rounds of clustering and curation. We uncovered more than ten thousand viral species distributed over 248 viral families falling within 17 viral order-level clades. Most of the defined viral families and orders were novel and belonged to the Caudoviricetes viral class. Bacterial hosts were predicted for 79% of the viral species using CRISPR spacers, including those in metagenomes from the same fecal samples. While Bacteroides -infecting Crassphages were present, novel viral families were more predominant, including phages infecting Clostridiales and Bifidobacterium . Phage lifestyles were determined for more than three thousand caudoviral species. Lifestyles were homogeneous at the family level for 149 Caudoviricetes families, including 32 families that were found to be virulent, while 117 were temperate. Virulent phage families were more abundant but temperate ones were more diverse and widespread. Together, the viral families found in this study represent a major expansion of existing bacteriophage taxonomy.

ABSTRACT Many prokaryotes encode CRISPR-Cas systems as immune protection against mobile genetic elements (MGEs), yet, a number of MGEs also harbor CRISPR-Cas components. With a few exceptions, CRISPR-Cas loci encoded on MGEs are uncharted and a comprehensive analysis of their distribution, prevalence, diversity, and function is lacking. Here, we systematically investigated CRISPR-Cas loci across the largest curated collection of natural bacterial and archaeal plasmids. CRISPR-Cas loci are widely but heterogeneously distributed across plasmids and, in comparison to host chromosomes, their mean prevalence per Mbp is higher and their distribution is markedly distinct. Furthermore, the spacer content of plasmid CRISPRs exhibits a strong targeting bias towards other plasmids, while chromosomal arrays are enriched with virus-targeting spacers. These contrasting targeting preferences dominate across the diversity of CRISPR-Cas subtypes and host taxa, highlighting the genetic independence of plasmids and suggesting a major role of CRISPR-Cas for mediating plasmid-plasmid conflicts. Altogether, CRISPR-Cas are frequent accessory components of many plasmids, which is an overlooked phenomenon that possibly facilitates their dissemination across microbiomes.

Summary Argonaute (Ago) proteins are widespread nucleic acid-guided enzymes that recognize targets through complementary base pairing. While in eukaryotes Agos are involved in RNA silencing, the functions of prokaryotic Agos (pAgos) remain largely unknown. In particular, a clade of truncated and catalytically inactive pAgos (short pAgos) lacks characterization. Here, we reveal that a short pAgo protein in Sulfolobus islandicus , together with its two genetically associated proteins, Aga1 and Aga2, provide robust antiviral protection via abortive infection. Aga2 is a membrane-associated toxic effector that binds anionic phospholipids via a basic pocket, which is essential for its cell killing ability. Ago and Aga1 form a stable complex that exhibits RNA-directed nucleic acid recognition ability and directly interacts with Aga2, pointing to an immune sensing mechanism. Together, our results highlight the cooperation between pAgos and their widespread associated proteins, suggesting an uncharted diversity of pAgo-derived immune systems that await to be discovered.

Summary Large cohort studies have contributed significantly to our understanding of the factors that influence the development of the bacterial component of the gut microbiome (GM) during the first years of life. However, the factors that shape the colonization by other important GM members such as the viral fraction remain more elusive. Most gut viruses are bacteriophages (phages), i.e., viruses attacking bacteria in a host specific manner, and to a lesser extent, but also widely present, eukaryotic viruses, including viruses attacking human cells. Here, we utilize the deeply phenotyped COPSAC2010 birth cohort consisting of 700 infants to investigate how social, pre-, peri- and postnatal factors may influence the gut virome composition at one year of age, where fecal virome data was available from 645 infants. Among the different exposures studied, having older siblings and living in an urban vs. rural area had the strongest impact on gut virome composition. Differential abundance analysis from a total of 16,118 viral operational taxonomic units (vOTUs) (mainly phages, but also 6.1% eukaryotic viruses) identified 2,105 vOTUs varying with environmental exposures, of which 5.9% were eukaryotic viruses and the rest was phages. Bacterial hosts for these phages were mainly predicted to be within the Bacteroidaceae, Prevotellaceae , and Ruminococcaceae families, as determined by CRISPR spacer matches. Spearman correlation coefficients indicated strong co-abundance trends of vOTUs and their targeted bacterial host, which underlined the predicted phage-host connections. Further, our findings show that some gut viruses encode important metabolic functions and how the abundance of genes encoding these functions is influenced by environmental exposures. Genes that were significantly associated with early life exposures were found in a total of 42 vOTUs. 18 of these vOTUs had their life styles predicted, with 17 of them having a temperate lifestyle. These 42 vOTUs carried genes coding for enzymes involved in alanine, aspartate and glutamate metabolism, glycolysis-gluconeogenesis, as well as fatty acid biosynthesis. The latter implies that these phages could be involved in the utilization and degradation of major dietary components and affect infant health by influencing the metabolic capacity of their bacterial host. Given the importance of the GM in early life for maturation of the immune system and maintenance of metabolic health, these findings provide a valuable source of information for understanding early life factors that predispose for autoimmune and metabolic disorders.

Summary Background: Bulk microbiome, as well as virome-enriched shotgun sequencing only reveals the double-stranded DNA (dsDNA) content of a given sample, unless specific treatments are applied. However, genomes of viruses often consist of a circular single-stranded DNA (ssDNA) molecule. Pre- treatment and amplification of DNA using the multiple displacement amplification (MDA) method enables conversion of ssDNA to dsDNA, but this process can lead to over-representation of these circular ssDNA genomes. A more recent alternative permits to bypass the amplification step, as library adapters are ligated to sheared and denatured DNA, after an end-modification step (xGen kit). However, the sonication step might shear ssDNA more efficiently than dsDNA, therefore introducing another bias in virome sequencing. These limitations prompted us to explore an alternative method of DNA preparation for sequencing mixed ssDNA and dsDNA viromes. Results: Using a synthetic mix of viral particles, we made use of the T7 DNA polymerase (T7pol) to convert viral circular ssDNA molecules to dsDNA, while preventing over-replication of such molecules, as is the case with the Phi29 DNA polymerase. Our findings indicate that using T7pol and a mix of degenerated primers to convert ssDNA to dsDNA prior library preparation is a good alternative to the currently used methods. It better represents the original synthetic mixtures compared to MDA or direct application of the xGen kit. Furthermore, when applied to two complex virome samples, the T7pol treatment improved both the richness and abundance in the Microviridae fraction. Conclusion: We conclude that T7pol pretreatment is preferable to MDA for the shotgun sequencing of viromes, which is easy to implement and inexpensive.

Abstract Reverse transcriptases (RTs) are enzymes capable of synthesizing DNA using RNA as a template. Within the last few years, a burst of research has led to the discovery of novel prokaryotic RTs with diverse antiviral properties, such as DRTs (Defense-associated RTs), which belong to the so-called group of unknown RTs (UG) and are closely related to the Abortive Infection system (Abi) RTs. In this work, we performed a systematic analysis of UG and Abi RTs, increasing the number of UG/Abi members up to 42 highly diverse groups, most of which are predicted to be functionally associated with other gene(s) or domain(s). Based on this information, we classified these systems into three major classes. In addition, we reveal that most of these groups are associated with defense functions and/or mobile genetic elements, and demonstrate the antiphage role of four novel groups. Besides, we highlight the presence of one of these systems in novel families of human gut viruses infecting members of the Bacteroidetes and Firmicutes phyla. This work lays the foundation for a comprehensive and unified understanding of these highly diverse RTs with enormous biotechnological potential.

CRISPR-Cas genes are extraordinarily diverse and evolve rapidly when compared to other prokaryotic genes. With the rapid increase in newly sequenced archaeal and bacterial genomes, manual identification of CRISPR-Cas systems is no longer viable. Thus, an automated approach is required for advancing our understanding of the evolution and diversity of these systems, and for finding new candidates for genome engineering in eukaryotic models. In this paper, we introduce a holistic strategy that combines regression and classification models for improving the quality of protein cascades, predicting their subtypes, detecting signature genes and extracting potential rules that reveal functional modules for CRISPR.

Abstract Even in the absence of antibiotic exposure, the gut microbiome of infants has been shown to contain numerous antibiotic resistance genes (ARGs), but the mechanism for this remains unclear. In environmental bacteria, the selective advantage of ARGs can be increased through co-localization with genes such as other ARGs, biocide resistance genes, metal resistance genes, and virulence genes. However, this phenomenon is unknown from the human gut microbiome during early life despite frequent exposures to biocides and metals from an early age. Here, we conducted a comprehensive analysis of genetic co-localization of resistance genes in a cohort of 662 Danish children and examined the association between such co-localization and environmental factors as well as gut microbial maturation. Our study showed that co-localization of ARGs with other resistance and virulence genes is common in the early gut microbiome and is associated with gut bacteria that are indicative of low maturity, especially E. coli . The most common forms of co-localization involved tetracycline and fluoroquinolone resistance genes located near other ARGs, and, on plasmids, co-localization predominantly occurred in the form of class 1 integrons. Antibiotic use caused a short-term increase in mobile ARGs, while non-mobile ARGs showed no significant change. Finally, we found that a high abundance of virulence genes was associated with low gut microbial maturity and that virulence genes showed even higher potential for mobility than ARGs. Our study highlights important constraints that need to be considered when developing strategies to combat ARG dissemination.

Abstract CRISPR-Cas loci encode for highly diversified prokaryotic adaptive defense systems that have recently become popular for their applications in gene editing and beyond. The increasing demand for bioinformatic tools that systematically detect and classify CRISPR-Cas systems has been largely challenged by their complex dynamic nature and rapidly expanding classification. Here, we developed CRISPRCasTyper, a new automated software tool with improved capabilities for identifying and typing CRISPR arrays and cas loci across prokaryotic sequences, based on the latest classification and nomenclature (39 subtypes/variants) (Makarova et al. 2020; Pinilla-Redondo et al. 2019). As a novel feature, CRISPRCasTyper uses a machine learning approach to subtype CRISPR arrays based on the sequences of the direct repeats. This allows the typing of orphan and distant arrays which, for example, are commonly observed in fragmented metagenomic assemblies. Furthermore, the tool provides a graphical output, where CRISPRs and cas operon arrangements are visualized in the form of colored gene maps, thus aiding annotation of partial and novel systems through synteny. Moreover, CRISPRCasTyper can resolve hybrid CRISPR-Cas systems and detect loci spanning the ends of sequences with a circular topology, such as complete genomes and plasmids. CRISPRCasTyper was benchmarked against a manually curated set of 31 subtypes/variants with a median accuracy of 98.6%. Altogether, we present an up-to-date and freely available software pipeline for significantly improved automated predictions of CRISPR-Cas loci across genomic sequences. Implementation CRISPRCasTyper is available through conda and PyPi under the MIT license ( https://github.com/Russel88/CRISPRCasTyper ), and is also available as a web server ( http://cctyper.crispr.dk ).