We describe an improved method for comparative modeling, RosettaCM, which optimizes a physically realistic all-atom energy function over the conformational space defined by homologous structures. Given a set of sequence alignments, RosettaCM assembles topologies by recombining aligned segments in Cartesian space and building unaligned regions de novo in torsion space. The junctions between segments are regularized using a loop closure method combining fragment superposition with gradient-based minimization. The energies of the resulting models are optimized by all-atom refinement, and the most representative low-energy model is selected. The CASP10 experiment suggests that RosettaCM yields models with more accurate side-chain and backbone conformations than other methods when the sequence identity to the templates is greater than ∼15%.

The fit of atomic models of protein structures to high-resolution cryo-electron microscopy maps can be assessed with a validation tool, EMRinger. Advances in high-resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) require the development of validation metrics to independently assess map quality and model geometry. We report EMRinger, a tool that assesses the precise fitting of an atomic model into the map during refinement and shows how radiation damage alters scattering from negatively charged amino acids. EMRinger ( https://github.com/fraser-lab/EMRinger ) will be useful for monitoring progress in resolving and modeling high-resolution features in cryo-EM.

Cryo-EM has revealed the structures of many challenging yet exciting macromolecular assemblies at near-atomic resolution (3–4.5Å), providing biological phenomena with molecular descriptions. However, at these resolutions, accurately positioning individual atoms remains challenging and error-prone. Manually refining thousands of amino acids – typical in a macromolecular assembly – is tedious and time-consuming. We present an automated method that can improve the atomic details in models that are manually built in near-atomic-resolution cryo-EM maps. Applying the method to three systems recently solved by cryo-EM, we are able to improve model geometry while maintaining the fit-to-density. Backbone placement errors are automatically detected and corrected, and the refinement shows a large radius of convergence. The results demonstrate that the method is amenable to structures with symmetry, of very large size, and containing RNA as well as covalently bound ligands. The method should streamline the cryo-EM structure determination process, providing accurate and unbiased atomic structure interpretation of such maps.

The Hsp90 molecular chaperone and its Cdc37 cochaperone help stabilize and activate more than half of the human kinome. However, both the mechanism by which these chaperones assist their "client" kinases and the reason why some kinases are addicted to Hsp90 while closely related family members are independent are unknown. Our structural understanding of these interactions is lacking, as no full-length structures of human Hsp90, Cdc37, or either of these proteins with a kinase have been elucidated. Here we report a 3.9 angstrom cryo-electron microscopy structure of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase complex. Surprisingly, the two lobes of Cdk4 are completely separated with the β4-β5 sheet unfolded. Cdc37 mimics part of the kinase N lobe, stabilizing an open kinase conformation by wedging itself between the two lobes. Finally, Hsp90 clamps around the unfolded kinase β5 strand and interacts with exposed N- and C-lobe interfaces, protecting the kinase in a trapped unfolded state. On the basis of this structure and an extensive amount of previously collected data, we propose unifying conceptual and mechanistic models of chaperone-kinase interactions.

Abstract Hsp90 is a conserved and essential molecular chaperone responsible for the folding and activation of hundreds of ‘client’ proteins 1,2 . The glucocorticoid receptor (GR) is a model client that constantly depends on Hsp90 for activity 3 . Previously, we revealed GR ligand binding is inhibited by Hsp70 and restored by Hsp90, aided by the cochaperone p23 4 . However, a molecular understanding of the chaperone-induced transformations that occur between the inactive Hsp70:Hsp90 ‘client-loading complex’ and an activated Hsp90:p23 ‘client-maturation complex’ is lacking for GR, or for any client. Here, we present a 2.56Å cryo-EM structure of the GR-maturation complex (GR:Hsp90:p23), revealing that the GR ligand binding domain is, surprisingly, restored to a folded, ligand-bound conformation, while simultaneously threaded through the Hsp90 lumen. Also, unexpectedly, p23 directly stabilizes native GR using a previously uncharacterized C-terminal helix, resulting in enhanced ligand-binding. This is the highest resolution Hsp90 structure to date and the first atomic resolution structure of a client bound to Hsp90 in a native conformation, sharply contrasting with the unfolded kinase:Hsp90 structure 5 . Thus, aided by direct cochaperone:client interactions, Hsp90 dictates client-specific folding outcomes. Together with the GR-loading complex structure (Wang et al. 2020), we present the molecular mechanism of chaperone-mediated GR remodeling, establishing the first complete chaperone cycle for any client.

Abstract Maintaining a healthy proteome is fundamental for organism survival 1,2 . Integral to this are Hsp90 and Hsp70 molecular chaperones that together facilitate the folding, remodeling and maturation of Hsp90’s many “client” proteins 3–7 . The glucocorticoid receptor (GR) is a model client strictly dependent upon Hsp90/Hsp70 for activity 8–13 . Chaperoning GR involves a cycle of inactivation by Hsp70, formation of an inactive GR:Hsp90:Hsp70:Hop “loading” complex, conversion to an active GR:Hsp90:p23 “maturation” complex, and subsequent GR release 14 . Unfortunately, a molecular understanding of this intricate chaperone cycle is lacking for any client. Here, we report the cryo-EM structure of the GR loading complex, in which Hsp70 loads GR onto Hsp90, revealing the molecular basis of direct Hsp90/Hsp70 coordination. The structure reveals two Hsp70s—one delivering GR and the other scaffolding Hop. Unexpectedly, the Hop cochaperone interacts with all components of the complex including GR, poising Hsp90 for subsequent ATP hydrolysis. GR is partially unfolded and recognized via an extended binding pocket composed of Hsp90, Hsp70 and Hop, revealing the mechanism of GR loading and inactivation. Together with the GR maturation complex (Noddings et al., 2020), we present the first complete molecular mechanism of chaperone-dependent client remodeling, establishing general principles of client recognition, inhibition, transfer and activation.

Abstract The microtubule (MT) cytoskeleton is central to cellular processes including axonal growth, intracellular transport, and cell division, all of which rely on precise spatiotemporal control of MT organization. Kinesin-8s play a key role in regulating MT length by combining highly processive directional motility with MT-end disassembly. However, how kinesin-8 switches between these two apparently opposing activities remains unclear. Here, we define the structural features underlying this molecular switch through cryo-EM analysis of the yeast kinesin-8, Kip3 bound to MTs, and molecular dynamics simulations to approximate the complex of Kip3 with the curved tubulin state found at the MT plus-end. By integrating biochemical and single-molecule biophysical assays, we identified specific intra- and intermolecular interactions that modulate processive motility and MT disassembly. Our findings suggest that Kip3 undergoes conformational changes in response to tubulin curvature that underlie its unique ability to interact differently with the MT lattice than with the MT-end.

Advances in electron cryomicroscopy allow for the building of de novo atomic models into high resolution Coulomb potential maps. While established validation metrics independently assess map quality and model geometry, methods to assess the precise fitting of an atomic model into the map and to validate the interpretation of high resolution features are less well developed. Here, we present EMRinger, which tests model-to-map agreement using side-chain dihedral-directed map density measurements. These measurements reveal local map density peaks and show that peaks located at rotameric angles are a sensitive marker of whether the backbone is correctly positioned. The EMRinger Score can be improved by model refinement, suggesting its utility as an effective model-to-map validation metric. Additionally, EMRinger sampling identifies how radiation damage alters scattering from negatively charged amino acids during data collection. EMRinger will be useful in assessing how advances in cryo-EM increase the ability to resolve and model high-resolution features.

Mitochondrial inheritance, genome maintenance, and metabolic adaptation all depend on organelle fission by Dynamin-Related Protein 1 (DRP1) and its mitochondrial receptors. DRP1 receptors include the paralogs Mitochondrial Dynamics 49 and 51 (MID49/MID51) and Mitochondrial Fission Factor (MFF), but the mechanisms by which these proteins recruit DRP1 and regulate its activities are unknown. Here we present a cryoEM structure of human, full-length DRP1 bound to MID49 and an analysis of structure- and disease-based mutations. We report that GTP binding allosterically induces a remarkable elongation and rotation of the G-domain, Bundle-Signaling Element (BSE) and connecting hinge loops of DRP1. In this nucleotide-bound conformation, a distributed network of multivalent interactions promotes DRP1 copolymerization into a linear filament with MID49, MID51 or both. Subsequent GTP hydrolysis and exchange within the filament leads to receptor dissociation, shortening through disassembly, and concomitant curling of DRP1 oligomers into closed rings. The dimensions of the closed DRP1 rings are consistent with DRP1-constricted mitochondrial tubules observed in human cells. These structures are the first views of full-length, receptor- and nucleotide-bound dynamin-family GTPases, and in comparison with nucleotide-free crystal structures, teach us how these molecular machines perform mechanical work through nucleotide-driven allostery.

The Hsp90 molecular chaperone and its Cdc37 co-chaperone help stabilize and activate over half of the human kinome. However, neither the mechanism by which these chaperones assist their client kinases nor why some kinases are addicted to Hsp90 while closely related family members are independent is known. Missing has been any structural understanding of these interactions, with no full-length structures of human Hsp90, Cdc37 or either of these proteins with a kinase. Here we report a 3.9A cryoEM structure of the Hsp90:Cdc37:Cdk4 kinase complex. Cdk4 is in a novel conformation, with its two lobes completely separated. Cdc37 mimics part of the kinase N-lobe, stabilizing an open kinase conformation by wedging itself between the two lobes. Finally, Hsp90 clamps around the unfolded kinase β5 strand and interacts with exposed N- and C-lobe interfaces, safely trapping the kinase in an unfolded state. Based on this novel structure and extensive previous data, we propose unifying conceptual and mechanistic models of chaperone-kinase interactions.