ABSTRACT Despite extensive efforts, reproducible assessment of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) heterogeneity and plasticity at the single cell level remains elusive. Systematic, network-based analysis of regulatory protein activity in single cells identified three PDA Developmental Lineages (PDLs), coexisting in virtually all tumors, whose transcriptional states are mechanistically driven by aberrant activation of Master Regulator (MR) proteins associated with gastrointestinal lineages (GLS state), morphogen and EMT pathways (MOS state), and acinar-to-ductal metaplasia (ALS state), respectively. Each PDL is further subdivided into sub-states characterized by low vs. high MAPK pathway activity. This taxonomy was remarkably conserved across multiple cohorts, cell lines, and PDX models, and harmonized with bulk profile analyses. Cross-state plasticity and MR essentiality was confirmed by barcode-based lineage tracing and CRISPR/Cas9 assays, respectively, while MR ectopic expression induced PDL transdifferentiation. Together these data provide a mechanistic foundation for PDA heterogeneity and a roadmap for targeting PDA cellular subtypes.

Abstract While single-cell RNA sequencing provides a remarkable window on pathophysiologic tissue biology and heterogeneity, its high gene-dropout rate and low signal-to-noise ratio challenge quantitative analyses and mechanistic understanding. To address this issue, we developed PISCES, a platform for the network-based, single-cell analysis of mammalian tissue. PISCES accurately estimates the mechanistic contribution of regulatory and signaling proteins to cell state implementation and maintenance, based on the expression of their lineage-specific transcriptional targets, thus supporting discovery and visualization of Master Regulators of cell state and cell state transitions. Experimental validation assays, including by assessing concordance with antibody and CITE-Seq-based measurements, show significant improvement in the ability to identify rare subpopulations and to elucidate key lineage markers, compared to gene expression analysis. Systematic analysis of single cell profiles in the Human Protein Atlas (HPA) produced a comprehensive resource for human tissue studies, supporting fine-grain stratification of distinct cell states, molecular determinants, and surface markers.

Abstract Pooled CRISPRi-mediated silencing of >1,000 transcriptional regulators expressed in single colorectal adenocarcinoma cells, followed by single-cell RNA-seq profiling at two timepoints, 1 day and 4 days, allowed reverse engineering the underlying tumor context-specific, causal regulatory network. Furthermore, the availability of experimentally derived, highly multiplexed gene reporter assays for each regulator, as identified by this analysis, allowed accurate assessment of differential protein activity following silencing of each regulator, thus providing proof-of-concept for generating comprehensive, tissue-specific networks of transcriptional and post-translational interactions. Analysis of this causal network allowed elucidation of complex autoregulatory mechanisms that have eluded previous computational approaches and supported systematic elucidation of cooperative mechanisms, where one regulatory protein can modulate the activity of another regulatory protein, as well as transcriptional mimicry, where one regulatory protein can phenocopy others.