Abstract SARS-CoV-2 is a newly emerged coronavirus (CoV) that spread through human populations worldwide in early 2020. CoVs rely on host cell proteases for activation and infection. The trypsin-like protease TMPRSS2 at the cell surface, cathepsin L in endolysosomes, and furin in the Golgi have all been implicated in the SARS-CoV-2 proteolytic processing. Whether SARS-CoV-2 depends on endocytosis internalization and vacuolar acidification for infectious entry remains unclear. Here, we examined the dynamics of SARS-CoV-2 activation during the cell entry process in tissue culture. Using four cell lines representative of lung, colon, and kidney epithelial tissues, we found that TMPRSS2 determines the SARS-CoV-2 entry pathways. In TMPRSS2-positive cells, infection was sensitive to aprotinin, a TMPRSS2 inhibitor, but not to SB412515, a drug that impairs cathepsin L. Infectious penetration was marginally dependent on endosomal acidification, and the virus passed the protease-sensitive step within 10 min. In a marked contrast, in TMPRSS2-negative cells cathepsin L and low pH were required for SARS-CoV-2 entry. The cathepsin L-activated penetration occurred within 40-60 min after internalization and required intact endolysosomal functions. Importantly, pre-activation of the virus allowed it to bypass the need for endosomal acidification for viral fusion and productive entry. Overall, our results indicate that SARS-CoV-2 shares with other CoVs a strategy of differential use of host cell proteases for activation and infectious penetration. This study also highlights the importance of TMPRSS2 in dictating the entry pathway used by SARS-CoV-2. Significance Preventing SARS-CoV-2 spread requires approaches affecting early virus-host cell interactions before the virus enters and infects target cells. Host cell proteases are critical for coronavirus activation and infectious entry. Here, we reconcile apparent contradictory observations from recent reports on endosomal acidification and the role of furin, TMPRSS2, and cathepsin L in the productive entry and fusion process of SARS-CoV-2. Investigating authentic virus in various cell types, we demonstrated that SARS-CoV-2 developed the ability to use different entry pathways, depending on the proteases expressed by the target cell. Our results have strong implications for future research on the apparent broad tropism of the virus in vivo . This study also provides a handle to develop novel antiviral strategies aiming to block virus entry, as illustrated with the several drugs that we identified to prevent SARS-CoV-2 infection, some with low IC 50 .

Abstract Objective Exacerbated pro-inflammatory immune response contributes to COVID-19 pathology. Despite the evidence about SARS-CoV-2 infecting the human gut, little is known about the importance of the enteric phase of SARS-CoV-2 for the viral lifecycle and for the development of COVID-19-associated pathologies. Similarly, it remains unknown whether the innate immune response triggered in this organ to combat viral infection is similar or distinct compared to the one triggered in other organs. Design We exploited human ileum- and colon-derived organoids as a non-transformed culture model supporting SARS-CoV-2 infection. We characterized the replication kinetics of SARS-CoV-2 in intestinal epithelial cells and correlated the expression of the viral receptor ACE2 with infection. We performed conventional and targeted single-cell transcriptomics and multiplex single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization and used IFN-reporter bioassays to characterize the response of primary human intestinal epithelial cells to SARS-CoV-2 infection. Results We identified a subpopulation of enterocytes as the prime target of SARS-CoV-2. We found the lack of positive correlation between susceptibility to infection and the expression of ACE2 and revealed that SARS-CoV-2 downregulates ACE2 expression upon infection. Infected cells activated strong proinflammatory programs and produced interferon, while expression of interferon-stimulated genes was limited to bystander cells due to SARS-CoV-2 suppressing the autocrine action of interferon in infected cells. Conclusion Our findings reveal that SARS-CoV-2 curtails the immune response in primary human intestinal epithelial cells to promote its replication and spread and this highlights the gut as a proinflammatory reservoir that should be considered to fully understand SARS-CoV-2 pathogenesis. Significance of the study What is already known about this subject? COVID-19 patients have gastrointestinal symptoms which likely correlates with SARS-CoV-2 infection of the intestinal epithelium SARS-CoV-2 replicates in human intestinal epithelial cells. Intestinal organoids are a good model to study SARS-CoV-2 infection of the gastrointestinal tract There is a limited interferon response in human lung epithelial cells upon SARS-CoV-2 infection. What are the new findings? A specific subpopulation of enterocytes are the prime targets of SARS-CoV-2 infection of the human gut. There is a lack of correlation between ACE2 expression and susceptibility to SARS-CoV-2 infection. SARS-CoV-2 downregulates ACE2 expression upon infection. Human intestinal epithelium cells produce interferon upon SARS-CoV-2 infection. Interferon acts in a paracrine manner to induce interferon stimulated genes that control viral infection only in bystander cells. SARS-CoV-2 actively blocks interferon signaling in infected cells. How might it impact on clinical practice in the foreseeable future? The absence of correlation between ACE2 levels and susceptibility suggest that medications influencing ACE2 levels (e.g. high blood pressure drugs) will not make patients more susceptible to SARS-CoV-2 infection. The restricted cell tropism and the distinct immune response mounted by the GI tract, suggests that specific cellular restriction/replication factors and organ specific intrinsic innate immune pathways can represent unique therapeutic targets to treat COVD-19 patients by considering which organ is most infected/impacted by SARS-CoV-2. The strong pro-inflammatory signal mounted by the intestinal epithelium can fuel the systemic inflammation observed in COVID-19 patients and is likely participating in the lung specific pathology.

Abstract Isogenic cells respond in a heterogeneous manner to interferon. Using a micropatterning approach combined with high-content imaging and spatial analyses, we characterized how the population context (position of a cell with respect to the neighboring cells) of human intestinal epithelial cells affects single cell response to interferons. We identified that cells at the edge of a cellular colony are significantly more responsive than cells embedded within this colony. We determined that this spatial heterogeneity in IFN response was the result of the polarized basolateral distribution of the IFN receptors making cells located in the center of a cellular colony not responsive to ectopic IFN stimulation. We could demonstrate that this population context driven cell-to-cell variability influences the outcome of viral infection as cells embedded in a cellular colony are not protected by interferons and therefore more susceptible to infection. Our data highlights that the behavior of individual isolated cells does not directly translate to their behavior in a population, placing the population context as a key driver of cell-to-cell heterogeneity in IFN response.

Abstract An important role for phenotype switching has been demonstrated in metastasis and therapeutic resistance of both melanoma and epithelial tumours. Phenotype switching in epithelial tumours is driven by a minority cancer stem cell sub-population with lineage plasticity, but such a sub-population has not been identified in melanoma. We investigated whether cell surface markers used to identify cancer stem cells in epithelial tumours could help to identify a cancer stem cell sub-population with lineage plasticity in melanoma. We identified a CD24+CD271+ minority sub-population in melanoma that possesses enhanced stem cell characteristics and lineage plasticity. We further found that that, unlike in epithelial tumours, more differentiated sub-populations in melanoma also possessed these attributes to a lesser extent. The CD24+CD271+ stem cell sub-population was observed in only 10% of human melanomas, mainly at the invasive front. The lack of this stem cell sub-population in the majority of human melanoma specimens led us to conclude that it may not be required for melanoma progression. This may be due to the observed diffuse nature of stem cell characteristics in melanoma. However, the enhanced self-renewal, lineage plasticity, invasive ability and drug resistance of the CD24+CD271+ sub-population may signal a contextual requirement for these stem cells when melanomas face challenging environments both in clinical melanoma and in experimental systems.

Abstract The coronavirus SARS-CoV-2 caused the COVID-19 global pandemic leading to 3.5 million deaths worldwide as of June 2021. The human intestine was found to be a major viral target which could have a strong impact on virus spread and pathogenesis since it is one of the largest organs. While type I interferons (IFNs) are key cytokines acting against systemic virus spread, in the human intestine type III IFNs play a major role by restricting virus infection and dissemination without disturbing homeostasis. Recent studies showed that both type I and III IFNs can inhibit SARS-CoV-2 infection, but it is not clear if one IFN controls SARS-CoV-2 infection of the human intestine better or with a faster kinetics. In this study, we could show that both type I and III IFNs possess antiviral activity against SARS-CoV-2 in human intestinal epithelial cells (hIECs), however type III IFN is more potent. Shorter type III IFN pretreatment times and lower concentrations were required to efficiently reduce virus load when compared to type I IFNs. Moreover, type III IFNs significantly inhibited SARS-CoV-2 even 4 hours post-infection and induced a long-lasting antiviral effect in hIECs. Importantly, the sensitivity of SARS-CoV-2 to type III IFNs was virus-specific since type III IFN did not control VSV infection as efficiently. Together these results suggest that type III IFNs have a higher potential for IFN-based treatment of SARS-CoV-2 intestinal infection as compared to type I IFNs.

Precise characterization and targeting of host cell transcriptional machinery hijacked by SARS-CoV-2 remains challenging. To identify therapeutically targetable mechanisms that are critical for SARS-CoV-2 infection, here we elucidated the Master Regulator (MR) proteins representing mechanistic determinants of the gene expression signature induced by SARS-CoV-2. The analysis revealed coordinated inactivation of MR-proteins linked to regulatory programs potentiating efficiency of viral replication ( detrimental host MR-signature ) and activation of MR-proteins governing innate immune response programs ( beneficial MR-signature ). To identify MR-inverting compounds capable of rescuing activity of inactivated host MR-proteins, with-out adversely affecting the beneficial MR-signature, we developed the ViroTreat algorithm. Overall, >80% of drugs predicted to be effective by this methodology induced significant reduction of SARS-CoV-2 infection, without affecting cell viability. ViroTreat is fully generalizable and can be extended to identify drugs targeting the host cell-based MR signatures induced by virtually any pathogen.