Abstract Membrane bending is a ubiquitous cellular process that is required for membrane traffic, cell motility, organelle biogenesis, and cell division. Proteins that bind to membranes using specific structural features, such as wedge-like amphipathic helices and crescent-shaped scaffolds, are thought to be the primary drivers of membrane bending. However, many membrane-binding proteins have substantial regions of intrinsic disorder, which lack a stable three-dimensional structure. Interestingly, many of these disordered domains have recently been found to form networks stabilized by weak, multi-valent contacts, leading to assembly of protein liquid phases on membrane surfaces. Here we ask how membrane-associated protein liquids impact membrane curvature. We find that protein phase separation on the surfaces of synthetic and cell-derived membrane vesicles creates a substantial compressive stress in the plane of the membrane. This stress drives the membrane to bend inward, creating protein-lined membrane tubules. A simple mechanical model of this process accurately predicts the experimentally measured relationship between the rigidity of the membrane and the diameter of the membrane tubules. Discovery of this mechanism, which may be relevant to a broad range of cellular protrusions, illustrates that membrane remodeling is not exclusive to structured scaffolds, but can also be driven by the rapidly emerging class of liquid-like protein networks that assemble at membranes. Significance Statement Cellular membranes take on an elaborate set of highly curved and bent shapes, which are essential to diverse cellular functions from endocytosis to cell division. The prevailing view has been that membrane bending is driven by proteins with curved shapes, which assemble at the membrane surface to form solid scaffolds. In contrast, here we show that proteins which form liquid-like assemblies on membranes are also potent drivers of bending. These “liquid scaffolds” apply compressive stress to the membrane surface, generating a diverse and dynamic family of membrane shapes. These data, which come at a time when liquid-like protein assemblies are being identified throughout the cell, suggest that liquid-like protein assemblies may play an important role in shaping cellular membranes.

Abstract Liquid-liquid phase separation of proteins has recently been observed on the surfaces of biological membranes, where it plays a role in diverse cellular processes, from assembly of focal adhesions and the immunological synapse, to biogenesis of trafficking vesicles. Interestingly in each of these cases, proteins on both surfaces of the membrane are thought to participate, suggesting that protein phase separation could be coupled across the membrane. To explore this possibility, we used an array of freestanding planar lipid membranes to observe protein phase separation simultaneously on both surfaces of lipid bilayers. When proteins known to engage in phase separation bound to the surfaces of these membranes, two-dimensional, protein-rich phases rapidly emerged. These phases displayed the hallmarks of a liquid, coarsening over time by fusing and re-rounding. Interestingly, we observed that protein-rich domains on one side of the membrane colocalized with those on the other side, resulting in transbilayer coupling. How do liquid-like protein phases communicate across the lipid bilayer? Our results, based on lipid probe partitioning and the differential mobility of proteins and lipids, collectively suggest an entropic coupling mechanism, which relies on the ability of protein phase separation to locally reduce the entropy of the underlying lipid membrane, most likely by increasing lipid packing. Regions of reduced entropy then colocalize across the bilayer to minimize the overall free energy of the membrane. These findings suggest a previously unknown mechanism by which cellular signals originating from one side of the membrane, triggered by protein phase separation, can be transferred to the opposite side.

Abstract Membrane curvature is essential to diverse cellular functions. While classically attributed to structured domains, recent work illustrates that intrinsically disordered proteins are also potent drivers of membrane bending. Specifically, repulsive interactions among disordered domains drive convex bending, while attractive interactions, which lead to liquid-like condensates, drive concave bending. How might disordered domains that contain both repulsive and attractive domains impact curvature? Here we examine chimeras that combine attractive and repulsive interactions. When the attractive domain was closer to the membrane, its condensation amplified steric pressure among repulsive domains, leading to convex curvature. In contrast, when the repulsive domain was closer to the membrane, attractive interactions dominated, resulting in concave curvature. Further, a transition from convex to concave curvature occurred with increasing ionic strength, which reduced repulsion while enhancing condensation. In agreement with a simple mechanical model, these results illustrate a set of design rules for membrane bending by disordered proteins.

Abstract Membrane-associated protein phase separation plays critical roles in cell biology, driving essential cellular phenomena from immune signaling to membrane traffic. Importantly, by restricting diffusion to a two-dimensional surface, lipid bilayers can nucleate phase separation at far lower concentrations compared to those required for phase separation in solution. How might other intracellular lipid substrates, such as lipid droplets, contribute to nucleation of phase separation? Distinct from bilayer membranes, lipid droplets consist of a phospholipid monolayer surrounding a core of neutral lipids, and they are energy storage organelles that protect cells from lipotoxicity and oxidative stress. Here, we show that intrinsically disordered proteins can undergo phase separation on the surface of synthetic and cell-derived lipid droplets. Specifically, we find that model disordered domains, FUS LC and LAF1-RGG, separate into protein-rich and protein-depleted phases on the surfaces of lipid droplets. Owing to the hydrophobic nature of interactions between FUS LC proteins, increasing ionic strength drives an increase in its phase separation on droplet surfaces. The opposite is true for LAF1-RGG, owing to the electrostatic nature of its interprotein interactions. In both cases, protein-rich phases on the surfaces of synthetic and cell-derived lipid droplets demonstrate molecular mobility indicative of a liquid-like state. Our results show that lipid droplets can nucleate protein condensates, suggesting that protein phase separation could be key in organizing biological processes involving lipid droplets.

Clathrin-mediated endocytosis is an essential cellular pathway that enables signaling and recycling of transmembrane proteins and lipids. During endocytosis, dozens of cytosolic proteins come together at the plasma membrane, assembling into a highly interconnected network that drives endocytic vesicle biogenesis. Recently, multiple labs have reported that early endocytic proteins form liquid-like condensates, which provide a flexible platform for the efficient assembly of endocytic vesicles. Given the importance of this network in the dynamics of endocytosis, how might cells regulate its stability? Many receptors and endocytic proteins are ubiquitylated, while early endocytic proteins such as Eps15 contain ubiquitin-interacting motifs. Therefore, we examined the influence of ubiquitin on the stability of the early endocytic protein network. In vitro, we found that recruitment of small amounts of polyubiquitin dramatically increased the stability of Eps15 condensates, suggesting that ubiquitylation could nucleate endocytic sites. In live cell imaging experiments, a version of Eps15 that lacked the ubiquitin-interacting motif failed to rescue defects in endocytic initiation created by Eps15 knockout. Furthermore, fusion of Eps15 to a deubiquitinase enzyme destabilized nascent endocytic sites within minutes. These results suggest that ubiquitylation drives assembly of the flexible protein network responsible for catalyzing endocytic events. More broadly, this work illustrates a biophysical mechanism by which ubiquitylated transmembrane proteins at the plasma membrane could regulate the efficiency of endocytic recycling.