Abstract Resistance (R) proteins recognize pathogen avirulence (Avr) proteins by direct or indirect binding and are multidomain proteins generally carrying a nucleotide binding (NB) and a leucine-rich repeat (LRR) domain. Two NB-LRR protein-coding genes from rice (Oryza sativa), RGA4 and RGA5, were found to be required for the recognition of the Magnaporthe oryzae effector AVR1-CO39. RGA4 and RGA5 also mediate recognition of the unrelated M. oryzae effector AVR-Pia, indicating that the corresponding R proteins possess dual recognition specificity. For RGA5, two alternative transcripts, RGA5-A and RGA5-B, were identified. Genetic analysis showed that only RGA5-A confers resistance, while RGA5-B is inactive. Yeast two-hybrid, coimmunoprecipitation, and fluorescence resonance energy transfer–fluorescence lifetime imaging experiments revealed direct binding of AVR-Pia and AVR1-CO39 to RGA5-A, providing evidence for the recognition of multiple Avr proteins by direct binding to a single R protein. Direct binding seems to be required for resistance as an inactive AVR-Pia allele did not bind RGA5-A. A small Avr interaction domain with homology to the Avr recognition domain in the rice R protein Pik-1 was identified in the C terminus of RGA5-A. This reveals a mode of Avr protein recognition through direct binding to a novel, non-LRR interaction domain.

SUMMARY Plant nucleotide-binding and leucine-rich repeat domain proteins (NLRs) are immune sensors that specifically recognize pathogen effectors and induce immune responses. Designing artificial NLRs with new effector recognition specificities is a promising prospect for sustainable, knowledge-driven crop protection. However, such strategies are hampered by the complexity of NLR function. Here, we tested whether molecular engineering of the integrated decoy domain (ID) of an NLR could extend its recognition spectrum to a new effector. To this aim, we relied on the detailed molecular knowledge of the recognition of distinct Magnaporthe oryzae MAX ( Magnaporthe AVRs and ToxB-like) effectors by the rice NLRs RGA5 and Pikp-1. For both NLRs, effector recognition involves physical binding to their HMA (Heavy Metal-Associated) IDs. However, AVR-PikD, the effector recognized by Pikp-1, binds to a completely different surface of the HMA domain compared to AVR-Pia and AVR1-CO39, recognized by RGA5. By introducing into the HMA domain of RGA5 the residues of the Pikp-1 HMA domain involved in AVR-PikD binding, we created a high-affinity binding surface for this new effector. In the Nicotiana benthamiana heterologous system, RGA5 variants carrying this engineered binding surface still recognize AVR-Pia and AVR1-CO39, but also perceive the new ligand, AVR-PikD, resulting in the activation of immune responses. Therefore, our study provides a proof of concept for the design of new effector recognition specificities in NLRs through molecular engineering of IDs. However, it pinpoints significant knowledge gaps that limit the full deployment of this NLR-ID engineering strategy and provides hypotheses for future research on this topic.

A complete description of the pathways and mechanisms of protein folding requires a detailed structural and energetic characterization of the folding energy landscape. Simulations, when corroborated by experimental data yielding global information on the folding process, can provide this level of insight. Molecular Dynamics (MD) has been associated often to force spectroscopy experiments to decipher the unfolding mechanism of titin Ig-like single- or multi-domain, the giant multi-modular protein from sarcomere, yielding information on the sequential events during titin unfolding under stretching. Here, we used high-pressure NMR to monitor the unfolding of titin I27 Ig-like single-domain and tandem. Since this method brings residue-specific information on the folding process, it can provide quasi-atomic details on this process, without the help of MD simulations. Globally, the results of our high-pressure analysis are in agreement with previous results obtained by the association of experimental measurements and MD simulation and/or protein engineering, although the intermediate folding state caused by the early detachment of the AB β-sheet, often reported in previous works based on MD or force spectroscopy, cannot be detected. On the other hand, the A'G parallel β-sheet of the β-sandwich has been confirmed as the Achilles heel of the 3D scaffold: its disruption yields complete unfolding, with very similar characteristics (free energy, unfolding volume, kinetics constant rates) for the two constructs.

Rust fungi are plant pathogens that secrete an arsenal of effector proteins interfering with plant functions and promoting parasitic infection. Effectors are often species-specific, evolve rapidly, and display low sequence similarities with known proteins or domains. How rust fungal effectors function in host cells remains elusive, and biochemical and structural approaches have been scarcely used to tackle this question. In this study, we used a strategy based on recombinant protein production in Escherichia coli to study eleven candidate effectors of the leaf rust fungus Melampsora larici-populina. We successfully purified and solved the three-dimensional structure of two proteins, MLP124266 and MLP124017, using NMR spectroscopy. Although both proteins show no sequence similarity with known proteins, they exhibit structural similarities to knottin and nuclear transport factor 2-like proteins, respectively. Altogether, our findings show that sequence-unrelated effectors can adopt folds similar to known proteins, and encourage the use of biochemical and structural approaches to functionally characterize rust effector candidates.

Plant pathogenic fungi secrete a wide variety of small proteins, named effectors. Magnaporthe AVRs and ToxB-like (MAX) effectors constitute a superfamily of secreted proteins widely distributed in Pyricularia (syn. Magnaporthe) oryzae, a devastating fungus responsible for blast disease in cereals such as rice. In spite of high evolutionary sequence divergence, MAX effectors share a common fold characterized by a β-sandwich core often stabilized by a conserved disulfide bond. In this study, we investigated the structural landscape and diversity within this effector family based on a previous phylogenetic analysis of P. oryzae protein sequences that identified 94 ortholog groups (OG) of putative MAX effectors. Combining protein structure modeling approaches and experimental structure determination, we validated the prediction of the conserved MAX core domain for 77 OG clusters. Four novel MAX effector structures determined by NMR were in remarkably good agreement with AlphaFold2 (AF) predictions. Based on the comparison of the AF-generated 3D models we propose an updated classification of the MAX effectors superfamily in 20 structural groups that highlight variation observed in the canonical MAX fold, disulfide bond patterns and decorating secondary structures in N- and C-terminal extensions. About one-third of the MAX family members remain single, showing no obvious structural relationship with other MAX effectors. Analysis of the surface properties of the AF MAX models also highlights the very high variability remaining within the MAX family when examined at the structural level, probably reflecting the wide diversity of their virulence functions and host targets.

Recent research has established that catabolic conversions within the jasmonate pathway have significant consequences on hormone signaling output. In dicotyledonous plants, the jasmonic acid oxidase (JAO) catabolic route is endowed with a regulatory function by diverting jasmonic acid (JA) towards hydroxylation, at the expense of its conjugation into the bioactive jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile) hormone. Here we functionally characterized the JAO pathway in rice (Oryza sativa) and demonstrate its prevalent function in promoting growth and attenuating JA responses in vegetative tissues. The rice genome contains four JAO-related homologs of which three generated hydroxy-JA in vitro and reverted the high defense phenotype when expressed in the Arabidopsis jao2-2 mutant. By generating and analyzing a series of single to quadruple rice jao mutants, we show the incremental effect of gradual JAO depletion on JA metabolism, basal defense levels, growth inhibition, fitness and global metabolic reprogramming. JAO-deficient lines were significantly growth-retarded at the juvenile stage, while recovering a near wild-type vegetative development after three months, where they exhibited a enhanced resistance to virulent and avirulent strains of Magnaporthe oryzae, the causal agent of fungal blast disease. Our findings identify the JAO pathway as an integral component of rice JA homeostasis and an important determinant of the growth-defense tradeoff. They demonstrate its conserved regulatory function in monocots and open possibilities for modulating selectively basal JA responses in a major cereal crop. Natural variation in JAO activity could also be explored as a mechanism underlying varying levels of JA signaling output in rice.