Abstract Polymorphonuclear leukocytes (PMNs, or neutrophils) are critical for human innate immunity and kill most invading bacteria. However, pathogens such as Staphylococcus aureus avoid destruction by PMNs to survive, thereby causing human infections. The molecular mechanisms used by pathogens to circumvent killing by the immune system remain largely undefined. To that end, we studied S. aureus pathogenesis and bacteria-PMN interactions using strains originally isolated from individuals with community-acquired (CA) and hospital-acquired infections. Compared with strains from hospital infections (COL and MRSA252), strain MW2 and a methicillin-susceptible relative, MnCop, were significantly more virulent in a mouse model of S. aureus infection, and caused the greatest level of pathology in major vital organs. Although phagocytosis of each strain triggered production of reactive oxygen species and granule-phagosome fusion, those from CA infections were significantly more resistant to killing by human PMNs and caused greater host cell lysis. Microarray analysis of the strains during neutrophil phagocytosis identified genes comprising a global S. aureus response to human innate host defense. Genes involved in capsule synthesis, gene regulation, oxidative stress, and virulence, were up-regulated following ingestion of the pathogen. Notably, phagocytosis of strains from CA infections induced changes in gene expression not observed in the other strains, including up-regulation of genes encoding virulence factors and hypothetical proteins. Our studies reveal a gene transcription program in a prominent human pathogen that likely contributes to evasion of innate host defense.

Cell-density-dependent gene regulation by quorum-sensing systems has a crucial function in bacterial physiology and pathogenesis. We demonstrate here that the Staphylococcus aureus agr quorum-sensing regulon is divided into (1) control of metabolism and PSM cytolysin genes, which occurs independently of the small regulatory RNA RNAIII, and (2) RNAIII-dependent control of additional virulence genes. Remarkably, PSM expression was regulated by direct binding of the AgrA response regulator. Our findings suggest that quorum-sensing regulation of PSMs was established before wide-ranging control of virulence was added to the agr regulon, which likely occurred by development of the RNAIII-encoding region around the gene encoding the PSM δ-toxin. Moreover, the agr regulon in the community-associated methicillin-resistant S. aureus MW2 considerably differed from that previously determined using laboratory strains. By establishing a two-level model of quorum-sensing target gene regulation in S. aureus, our study gives important insight into the evolution of virulence control in this leading human pathogen.

Chlamydia trachomatis is one of the most common bacterial pathogens and is the etiological agent of debilitating sexually transmitted and ocular diseases in humans. The organism is an obligate intracellular prokaryote characterized by a highly specialized biphasic developmental cycle. We have performed genomic transcriptional analysis of the chlamydial developmental cycle. This approach has led to the identification of a small subset of genes that control the primary (immediate-early genes) and secondary (late genes) differentiation stages of the cycle. Immediate-early gene products initiate bacterial metabolism and potentially modify the bacterial phagosome to escape fusion with lysosomes. One immediate early gene (CT147) is a homolog of the human early endosomal antigen-1 that is localized to the chlamydial phagosome; suggesting a functional role for CT147 in establishing the parasitophorous vacuole in a nonfusogenic pathway. Late gene products terminate bacterial cell division and constitute structural components and remodeling activities involved in the formation of the highly disulfide cross-linked outer-membrane complex that functions in attachment and invasion of new host cells. Many of the genes expressed during the immediate-early and late differentiation stages are Chlamydia -specific and have evolutionary origins in eukaryotic lineages.

An emerging theme in medical microbiology is that extensive variation exists in gene content among strains of many pathogenic bacterial species. However, this topic has not been investigated on a genome scale with strains recovered from patients with well-defined clinical conditions. Staphylococcus aureus is a major human pathogen and also causes economically important infections in cows and sheep. A DNA microarray representing >90% of the S. aureus genome was used to characterize genomic diversity, evolutionary relationships, and virulence gene distribution among 36 strains of divergent clonal lineages, including methicillin-resistant strains and organisms causing toxic shock syndrome. Genetic variation in S. aureus is very extensive, with approximately 22% of the genome comprised of dispensable genetic material. Eighteen large regions of difference were identified, and 10 of these regions have genes that encode putative virulence factors or proteins mediating antibiotic resistance. We find that lateral gene transfer has played a fundamental role in the evolution of S. aureus. The mec gene has been horizontally transferred into distinct S. aureus chromosomal backgrounds at least five times, demonstrating that methicillin-resistant strains have evolved multiple independent times, rather than from a single ancestral strain. This finding resolves a long-standing controversy in S. aureus research. The epidemic of toxic shock syndrome that occurred in the 1970s was caused by a change in the host environment, rather than rapid geographic dissemination of a new hypervirulent strain. DNA microarray analysis of large samples of clinically characterized strains provides broad insights into evolution, pathogenesis, and disease emergence.

Acute rheumatic fever (ARF), a sequelae of group A Streptococcus (GAS) infection, is the most common cause of preventable childhood heart disease worldwide. The molecular basis of ARF and the subsequent rheumatic heart disease are poorly understood. Serotype M18 GAS strains have been associated for decades with ARF outbreaks in the U.S. As a first step toward gaining new insight into ARF pathogenesis, we sequenced the genome of strain MGAS8232, a serotype M18 organism isolated from a patient with ARF. The genome is a circular chromosome of 1,895,017 bp, and it shares 1.7 Mb of closely related genetic material with strain SF370 (a sequenced serotype M1 strain). Strain MGAS8232 has 178 ORFs absent in SF370. Phages, phage-like elements, and insertion sequences are the major sources of variation between the genomes. The genomes of strain MGAS8232 and SF370 encode many of the same proven or putative virulence factors. Importantly, strain MGAS8232 has genes encoding many additional secreted proteins involved in human-GAS interactions, including streptococcal pyrogenic exotoxin A (scarlet fever toxin) and two uncharacterized pyrogenic exotoxin homologues, all phage-associated. DNA microarray analysis of 36 serotype M18 strains from diverse localities showed that most regions of variation were phages or phage-like elements. Two epidemics of ARF occurring 12 years apart in Salt Lake City, UT, were caused by serotype M18 strains that were genetically identical, or nearly so. Our analysis provides a critical foundation for accelerated research into ARF pathogenesis and a molecular framework to study the plasticity of GAS genomes.

ABSTRACT Prosthetic joint replacements are used increasingly to alleviate pain and improve mobility of the progressively older and more obese population. Implant infection occurs in about 5% of patients and entails significant morbidity and high social costs. It is most often caused by staphylococci, which are introduced perioperatively. They are a source of prolonged seeding and difficult to treat due to antibiotic resistance; therefore, infection prevention by prosthesis coating with nonantibiotic-type anti-infective substances is indicated. A renewed interest in topically used silver has fostered development of silver nanoparticles, which, however, present a potential health hazard. Here we present new silver coordination polymer networks with tailored physical and chemical properties as nanostructured coatings on metallic implant substrates. These compounds exhibited strong biofilm sugar-independent bactericidal activity on in vitro -grown biofilms and prevented murine S taphylococcus epidermidis implant infection in vivo with slow release of silver ions and limited transient leukocyte cytotoxicity. Furthermore, we describe the biochemical and molecular mechanisms of silver ion action by gene screening and by targeting cell metabolism of S. epidermidis at different levels. We demonstrate that silver ions inactivate enzymes by binding sulfhydryl (thiol) groups in amino acids and promote the release of iron with subsequent hydroxyl radical formation by an indirect mechanism likely mediated by reactive oxygen species. This is the first report investigating the global metabolic effects of silver in the context of a therapeutic application. We anticipate that the compounds presented here open a new treatment field with a high medical impact.

The inability to propagate obligate intracellular pathogens under axenic (host cell-free) culture conditions imposes severe experimental constraints that have negatively impacted progress in understanding pathogen virulence and disease mechanisms. Coxiella burnetii , the causative agent of human Q (Query) fever, is an obligate intracellular bacterial pathogen that replicates exclusively in an acidified, lysosome-like vacuole. To define conditions that support C. burnetii growth, we systematically evaluated the organism's metabolic requirements using expression microarrays, genomic reconstruction, and metabolite typing. This led to development of a complex nutrient medium that supported substantial growth (approximately 3 log 10 ) of C. burnetii in a 2.5% oxygen environment. Importantly, axenically grown C. burnetii were highly infectious for Vero cells and exhibited developmental forms characteristic of in vivo grown organisms. Axenic cultivation of C. burnetii will facilitate studies of the organism's pathogenesis and genetics and aid development of Q fever preventatives such as an effective subunit vaccine. Furthermore, the systematic approach used here may be broadly applicable to development of axenic media that support growth of other medically important obligate intracellular pathogens.

Two-component gene regulatory systems composed of a membrane-bound sensor and cytoplasmic response regulator are important mechanisms used by bacteria to sense and respond to environmental stimuli. Group A Streptococcus, the causative agent of mild infections and life-threatening invasive diseases, produces many virulence factors that promote survival in humans. A two-component regulatory system, designated covRS (cov, control of virulence; csrRS), negatively controls expression of five proven or putative virulence factors (capsule, cysteine protease, streptokinase, streptolysin S, and streptodornase). Inactivation of covRS results in enhanced virulence in mouse models of invasive disease. Using DNA microarrays and quantitative RT-PCR, we found that CovR influences transcription of 15% (n = 271) of all chromosomal genes, including many that encode surface and secreted proteins mediating host-pathogen interactions. CovR also plays a central role in gene regulatory networks by influencing expression of genes encoding transcriptional regulators, including other two-component systems. Differential transcription of genes influenced by covR also was identified in mouse soft-tissue infection. This analysis provides a genome-scale overview of a virulence gene network in an important human pathogen and adds insight into the molecular mechanisms used by group A Streptococcus to interact with the host, promote survival, and cause disease.

To better understand the molecular events involved in the origin of new pathogenic bacteria, we studied the evolution of a highly virulent clone of serotype M1 group A Streptococcus (GAS). Genomic, DNA-DNA microarray, and single-nucleotide polymorphism analyses indicated that this clone evolved through a series of horizontal gene transfer events that involved (1) the acquisition of prophages encoding streptococcal pyrogenic exotoxin A and extracellular DNases and (2) the reciprocal recombination of a 36-kb chromosomal region encoding the extracellular toxins NAD+-glycohydrolase (NADase) and streptolysin O (SLO). These gene transfer events were associated with significantly increased production of SLO and NADase. Virtual identity in the 36-kb region present in contemporary serotype M1 and M12 isolates suggests that a serotype M12 strain served as the donor of this region. Multiple horizontal gene transfer events were a crucial factor in the evolutionary origin and emergence of a very abundant contemporary clone of serotype M1 GAS

The molecular basis underlying the pathogenic success of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) is not completely understood, but differential gene expression has been suggested to account at least in part for the high virulence of CA-MRSA strains. Here, we show that the agr gene regulatory system has a crucial role in the development of skin infections in the most prevalent CA-MRSA strain USA300. Importantly, our data indicate that this is due to discrepancies between the agr regulon of CA-MRSA and those of hospital-associated MRSA and laboratory strains. In particular, agr regulation in strain USA300 led to exceptionally strong expression of toxins and exoenzymes, upregulation of fibrinogen-binding proteins, increased capacity to bind fibrinogen, and increased expression of methicillin resistance genes. Our findings demonstrate that agr functionality is critical for CA-MRSA disease and indicate that an adaptation of the agr regulon contributed to the evolution of highly pathogenic CA-MRSA.