Abstract As identifying proteins is of paramount importance for cell biology and applications, it is of interest to develop a protein sequencer with the ultimate sensitivity of decoding individual proteins. Here, we demonstrate a nanopore-based single-molecule sequencing approach capable of reliably detecting single amino-acid substitutions within individual peptides. A peptide is linked to a DNA molecule that is pulled through the biological nanopore MspA by a DNA helicase in single amino-acid steps. The peptide sequence yields clear stepping ion current signals which allows to discriminate single-amino-acid substitutions in single reads. Molecular dynamics simulations show these signals to result from size exclusion and pore binding. Notably, we demonstrate the capability to ‘rewind’ peptide reads, obtaining indefinitely many independent reads of the same individual molecule, yielding virtually 100% read accuracy in variant identification, with an error rate less than 10 −6 . These proof-of-concept experiments constitute a promising basis for developing a single-molecule protein sequencer. One-sentence summary This paper presents proof-of-concept experiments and simulations of a nanopore-based approach to sequencing individual proteins.

Abstract Nanopore sensors could revolutionize single-molecule proteomics by providing a means for identification of known proteins through fingerprinting or by de novo sequencing. However, the complex chemical and physical properties of proteins present multiple challenges to the conventional nanopore sensing method, predominantly, the single-file threading of a protein chain into a nanopore and its transport through it. Herein we describe a general approach for realizing unidirectional transport of full-length proteins through nanopores. We show that the combination of a chemically resistant biological nanopore platform and a high concentration guanidinium chloride buffer enables protein unfolding and unidirectional transport through a pore, propelled by an electroosmotic effect that largely owes to the guanidinium chloride presence. The uniform and slow (~10 µs/amino acid) single-file transport, when combined with supervised machine learning of the electrical current signatures obtained, allows us to use to discern the protein threading orientation and identity. In conjunction with a method for tail-modification of native proteins and higher-resolution nanopores, our approach could offer a path towards direct single-molecule protein fingerprinting without the requirement of a motor enzyme.

ABSTRACT Accurate localization of biomolecules is pivotal for understanding biological processes. Utilizing the atomically flat surface of 2D materials offers a promising route to achieve this without the need for tethering or constraining. Here we comprehensively investigate the binding and diffusion of DNA on hexagonal boron nitride (hBN) surfaces. Our findings reveal non-specific binding of DNA to pristine hBN, with subsequent diffusion and confinement within the 2D plane. Through single-molecule experiments and computational techniques, we explore DNA dynamics, and the effects of defects, step edges and domain boundaries on the motion, which gives insights on the interactions between solid-state surfaces and biomolecules. By engineering a narrow hBN ribbon structure, we enhance confinement, demonstrating its potential in nanofluidic guiding of biomolecules. Our 2D platform serves as a proving ground for next generation high-throughput single-molecule manipulation techniques for enabling applications in biotechnology and nanotechnology.

Abstract Designed and engineered protein and DNA nanopores can sense and characterize single molecules and control transmembrane transport of molecular species. However, designed biomolecular pores are less than 100 nm in length and are used primarily for transport across lipid membranes. Nanochannels that span longer distances could be used as conduits for molecules between non-adjacent compartments or cells. Here, we design microns-long, 7 nm diameter DNA nanochannels that small molecules can traverse according to the laws of continuum diffusion. Binding DNA origami caps to channel ends eliminates transport and demonstrates that molecules diffuse from one channel end to the other rather than permeating through channel walls. These micron-length nanochannels can also grow, form interconnects, and interface with living cells. This work thus shows how to construct multifunctional, dynamic agents that control molecular transport, opening new ways of studying intercellular signaling and modulating molecular transport between synthetic and living cells. Abstract Figure

Abstract The intricate interplay between DNA and proteins is key for biological functions such as DNA replication, transcription, and repair. To better understand these interactions, it is crucial to develop tools to study DNA-protein complexes with high spatial and temporal resolution. Here, we use the vertical orientation that DNA adopts on graphene and investigate its interactions with proteins via energy transfer from a probe dye to graphene, achieving spatial resolution down to the Ångström scale. We measured the bending angle of DNA induced by adenine tracts, bulges, abasic sites and the binding of Escherichia coli endonuclease IV with unprecedented precision and millisecond time resolution. Additionally, we observed the translocation of the O 6 -alkylguanine DNA alkyltransferase along double-stranded DNA, reaching single-base pair resolution and detecting an affinity for adenine tracts. Overall, we foresee that this method will become a widespread tool for the dynamical study of nucleic acid and nucleic acid-protein interactions.

Posttranslational modifications (PTMs) of proteins are crucial for cellular function but pose analytical problems, especially in distinguishing chemically identical PTMs at different nearby locations within the same protein. Current methods, such as liquid chromatography-tandem mass spectrometry, are technically tantamount to de novo protein sequencing 1 . Nanopore techniques may provide a more efficient solution, but applying the concepts of nanopore DNA strand sequencing to proteins still faces fundamental problems 2–4 . Here, we demonstrate the use of an engineered biological nanopore to differentiate positional isomers resulting from acetylation or methylation of histone protein H4, an important PTM target 5,6 . In contrast to strand sequencing, we differentiate positional isomers by recording ionic current modulations resulting from the stochastic entrapment of entire peptides in the pore’s sensing zone, with all residues simultaneously contributing to the electrical signal. Molecular dynamics simulations show that, in this whole-molecule sensing mode, the non-uniform distribution of the electric potential within the nanopore makes the added resistance contributed by a PTM dependent on its precise location on the peptide. Optimization of the pore’s sensitivity in combination with parallel recording and automated and standardized protein fragmentation may thus provide a simple, label-free, high-throughput analytical platform for identification and quantification of PTMs.

Abstract Biological condensates have emerged as key elements of a biological cell function, concentrating disparate biomolecules to accomplish specific biological tasks. RNA was identified as a key ingredient of such condensates, however, its effect on the physical properties of the condensate was found to depend on the condensate’s composition while its effect on the microstructure has remained elusive. Here, we characterize the physical properties and the microstructure of a protein–RNA condensate by means of large-scale coarse-grained (CG) molecular dynamics simulations. By developing a custom CG model of RNA compatible with a popular CG model of proteins, we systematically investigate the structural, thermodynamic, and kinetic properties of condensate droplets containing thousands of individual protein and RNA molecules over a range of temperatures. While we find RNA to increase the condensate’s cohesiveness, its effect on the condensate’s fluidity is more nuanced with longer molecules compacting the condensate and making it less fluid. We show that a biological condensate has a sponge-like morphology of interconnected channels of size that increases with temperature and decreases in the presence of RNA. Our results suggest that longer RNA form a dynamic scaffold within a condensate, regulating not only its fluidity but also permeability to intruder molecules.

Electrophoretic transport plays a pivotal role in advancing sensing technologies, with A-form nucleic acids, predominantly RNA-containing, emerging as the new frontier for nanopore sensing and sequencing. Here, we compare the less-explored dynamics of A-form electrophoretic transport with the well-researched transport of B-form DNA. Using DNA/RNA nanotechnology and solid-state nanopores, the translocation of RNA:DNA (RD) and DNA:DNA (DD) duplexes was examined. Notably, RD duplexes were found to translocate through nanopores up to 1.8 times faster than DD duplexes, despite containing the same number of base pairs. Our experiments reveal that A- and B-form duplex molecules with the same contour length move with comparable velocity through nanopores. We examined the physical characteristics of both duplex forms using atomic force microscopy, agarose gel electrophoresis, and dynamic light scattering measurements. With the help of coarse-grained and atomistic molecular dynamics simulations, we find the effective force applied by the electric field to a fragment of A-form or B-form duplex in a nanopore to be approximately the same. Our results shed light on the significance of helical form in nucleic acid translocation, with implications for RNA sensing, sequencing, and molecular understanding of electrophoretic transport.

ABSTRACT Poly(ADP-ribose) (PAR), as part of a post-translational modification, serves as a flexible scaffold for noncovalent protein binding. Such binding is influenced by PAR chain length through a mechanism yet to be elucidated. Structural insights have been elusive, partly due to the difficulties associated with synthesizing PAR chains of defined lengths. Here, we employ an integrated approach combining molecular dynamics (MD) simulations with small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments, enabling us to identify highly heterogeneous ensembles of PAR conformers at two different, physiologically relevant lengths: PAR 15 and PAR 22 . Our findings reveal that numerous factors including backbone conformation, base stacking, and chain length contribute to determining the structural ensembles. We also observe length-dependent compaction of PAR upon the addition of small amounts of Mg 2+ ions, with the 22-mer exhibiting ADP-ribose bundles formed through local intramolecular coil-to-globule transitions. This study illuminates how such bundling could be instrumental in deciphering the length-dependent action of PAR. GRAPHICAL ABSTRACT

Selective transport of ions through nanometer-sized pores is fundamental to cell biology and central to many technological processes such as water desalination and electrical energy storage. Conventional methods for generating ion selectivity include placement of fixed electrical charges at the inner surface of a nanopore through either point mutations in a protein pore or chemical treatment of a solid-state nanopore surface, with each nanopore type requiring a custom approach. Here, we describe a general method for transforming a nanoscale pore into a highly selective, anion-conducting channel capable of generating a giant electro-osmotic effect. Our molecular dynamics simulations and reverse potential measurements show that exposure of a biological nanopore to high concentrations of guanidinium chloride renders the nanopore surface positively charged due to transient binding of guanidinium cations to the protein surface. A comparison of four biological nanopores reveals the relationship between ion selectivity, nanopore shape, composition of the nanopore surface, and electro-osmotic flow. Remarkably, guanidinium ions are also found to produce anion selectivity and a giant electro-osmotic flow in solid-state nanopores via the same mechanism. Our sticky-ion approach to generate electro-osmotic flow can have numerous applications in controlling molecular transport at the nanoscale and for detection, identification, and sequencing of individual proteins.