Article15 October 2003free access Redox regulation of PI 3-kinase signalling via inactivation of PTEN Nick R. Leslie Corresponding Author Nick R. Leslie Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Deborah Bennett Deborah Bennett Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Yvonne E. Lindsay Yvonne E. Lindsay Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Hazel Stewart Hazel Stewart Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Alex Gray Alex Gray Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author C.Peter Downes C.Peter Downes Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Nick R. Leslie Corresponding Author Nick R. Leslie Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Deborah Bennett Deborah Bennett Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Yvonne E. Lindsay Yvonne E. Lindsay Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Hazel Stewart Hazel Stewart Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Alex Gray Alex Gray Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author C.Peter Downes C.Peter Downes Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Author Information Nick R. Leslie 1, Deborah Bennett1, Yvonne E. Lindsay1, Hazel Stewart1, Alex Gray1 and C.Peter Downes1 1Division of Cell Signalling, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH UK *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2003)22:5501-5510https://doi.org/10.1093/emboj/cdg513 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The tumour suppressor PTEN is a PtdIns(3,4,5)P3 phosphatase that regulates many cellular processes through direct antagonism of PI 3-kinase signalling. Here we show that oxidative stress activates PI 3-kinase-dependent signalling via the inactivation of PTEN. We use two assay systems to show that cellular PTEN phosphatase activity is inhibited by oxidative stress induced by 1 mM hydrogen peroxide. PTEN inactivation by oxidative stress also causes an increase in cellular PtdIns(3,4,5)P3 levels and activation of the downstream PtdIns(3,4,5)P3 target, PKB/Akt, that does not occur in cells lacking PTEN. We then show that endogenous oxidant production in RAW264.7 macrophages inactivates a fraction of the cellular PTEN, and that this is associated with an oxidant-dependent activation of downstream signalling. These results show that oxidants, including those produced by cells, can activate downstream signalling via the inactivation of PTEN. This demonstrates a novel mechanism of regulation of the activity of this important tumour suppressor and the signalling pathways it regulates. These results may have significant implications for the many cellular processes in which PtdIns(3,4,5)P3 and oxidants are produced concurrently. Introduction The phosphoinositide 3-kinase (PI 3-kinase) cellular signalling pathway plays a pivotal role in controlling numerous biological processes, including cellular survival, proliferation, growth and motility and is deregulated in numerous human tumour types (Cantrell, 2001; Katso et al., 2001; Vanhaesebroeck et al., 2001; Cantley, 2002). The pathway is characterized by the stimulated production of the second messenger, phosphatidylinositol (3,4,5) trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P3] by Class I PI 3-kinase enzymes. PtdIns(3,4,5)P3 activates downstream signalling through proteins able specifically to recognize and to bind this lipid. The importance of deregulation of this pathway in tumour development was highlighted by the demonstration that the tumour suppressor, PTEN, is a PtdIns(3,4,5)P3 3-phosphatase, and in many cell types may mediate the principle route of metabolism of this signalling molecule (Maehama et al., 2001; Simpson and Parsons, 2001; Leslie and Downes, 2002). Thus, PTEN can inhibit entry into the cell cycle, metastasis and cell motility, promote apoptosis, and reduce cell growth and size (Furnari et al., 1998; Stambolic et al., 1998; Tamura et al., 1998; Sun et al., 1999; Backman et al., 2002; Davies et al., 2002). However, despite intensive research, a clear picture is yet to emerge of how cells regulate the activity of PTEN. The abundance of PTEN can be regulated transcriptionally (Patel et al., 2001; Virolle et al., 2001) and through phosphorylation-dependent modulation of protein stability (Vazquez et al., 2000; Torres and Pulido, 2001). PTEN can also be recruited into protein complexes through interaction with PDZ domain-containing proteins (Wu,X. et al., 2000; Wu,Y. et al., 2000) and may be selectively recruited onto cellular membrane surfaces that display a more acidic character, such as the inner leaflet of the plasma membrane (Das et al., 2003; McConnachie et al., 2003). However, the significance of much of this data with regard to the cellular regulation of the PI 3-kinase pathway and downstream processes is currently unclear (Leslie et al., 2001; Birle et al., 2002). It has become clear that reactive oxygen species (ROS) are not simply damaging by-products of cellular metabolism, but also play important regulatory roles in many cellular processes (Finkel, 2000; Droge, 2002). For example, the stimulated production of oxidants appears to play a crucial role in the mitogenic response to many growth factors (Chen et al., 1995; Sundaresan et al., 1995; Bae et al., 1997). Recent work has indicated that members of the Protein Tyrosine Phosphatase family, which include the lipid phosphatase, PTEN, can be physiologically regulated through reversible oxidation and inactivation (Denu and Tanner, 1998; Lee et al., 1998; Meng et al., 2002). These enzymes contain a critical cysteine residue in the active site that must be in a reduced state in order to participate in catalysis (Denu and Tanner, 1998; Tonks and Neel, 2001). Consistent with this, PTEN was found to require reducing conditions for optimal activity in vitro (Maehama and Dixon, 1998; Myers et al., 1998). More recently, evidence has shown that inactivation by oxidation might represent a physiological mechanism of regulation of this class of enzymes, not only by oxidative stress, but by ROS produced in other cellular circumstances, including stimulation of cells by growth factors (Meng et al., 2002). A recent study extended these proposals to include PTEN, showing that oxidation of this enzyme in vitro by hydrogen peroxide (H2O2) caused inactivation and the formation of a disulfide bond between the active site cysteine (C124), and another nearby cysteine (C71). This study also showed that H2O2, either in vitro, or in cultured cells caused a reversible shift in the electrophoretic mobility of PTEN consistent with its oxidation (Lee et al., 2002), but did not investigate effects on downstream signalling. Here we show for the first time direct evidence for the oxidative inactivation of PTEN in cells, by both exogenous and endogenously produced oxidants. We also show that oxidants cause an increase in the levels of PtdIns(3,4,5)P3 and activate downstream signalling, and that these effects do not occur in cells lacking PTEN. Results PTEN is sensitive to oxidative inactivation in vitro PtdIns(3,4,5)P3 is believed to be metabolized largely by two distinct cellular pathways; dephosphorylation of the 3 position by PTEN, to produce PtdIns(4,5)P2, or dephosphorylation of the 5 position by members of a family of 5-phosphatases, to produce PtdIns(3,4)P2. We therefore chose to analyse the sensitivity to oxidation of human PTEN by H2O2 in vitro in comparison with human SHIP-2, a structurally unrelated PtdIns(3,4,5)P3 5-phosphatase that uses a different mechanism of catalysis (Figure 1). These studies revealed that the sensitivity of PTEN to oxidation is such that washing the enzyme in ambient conditions in buffers lacking added reducing or oxidizing agents causes substantial loss of activity, relative to the full activity recovered after washing in reducing conditions (5 mM DTT). Addition of H2O2, even at 10 μM, caused an almost complete loss of activity. In contrast, SHIP-2 still displayed strong activity in the presence of 10 mM H2O2. The apparent sensitivity of PTEN to oxidation in vitro (Figure 1A) is somewhat conflicting with data presented by Lee et al. (2002), showing that a 50% reduction in PTEN phosphatase activity was caused by ∼200 μM H2O2. Although the exact redox potential is not known in these experiments, we obtained similar results to their data when directly diluting PTEN enzyme that is stored in buffers containing reducing agents (data not shown), suggesting that the sensitivity of PTEN to oxidation may be underestimated in these latter experiments through reaction of applied oxidants with reducing agents in these storage buffers. Figure 1.PTEN, but not SHIP-2, is highly sensitive to oxidative inactivation in vitro. Recombinant PTEN (A) and SHIP-2 (B) were separately purified by affinity chromatography and immunoprecipitation respectively. Enzymes were then washed in ambient conditions lacking additional reducing or oxidizing agents, and then assayed in the presence of either 5 mM DTT, no additional reducing or oxidizing agents, or of different concentrations of H2O2. Data in (A) show d.p.m. released labelled phosphate, and in (B) show production of labelled PtdIns(3,4)P2 determined by densitometry. Presented data points represent the mean of assays performed in duplicate and the range of these duplicates. The measured activity using boiled enzyme is presented as a negative control. Download figure Download PowerPoint Oxidative stress inactivates cellular PTEN In order to analyse the regulation of PTEN by oxidation in cells, we adapted a novel assay described by Meng et al. (2002). This assay uses lysis buffers containing iodoacetic acid (IAA) irreversibly to alkylate cysteine residues in cellular proteins and is represented diagrammatically in Figure 2A. Alkylation of the active site cysteine residue of PTP family members results in irreversible inactivation. However, oxidized cysteine residues are protected from alkylation and, since their oxidation is reversible, they can be recovered in the absence of IAA and assayed. Thus, the resultant activity data represents the proportion of the phosphatase that is oxidized (and inactive) at the moment of lysis (Meng et al., 2002). The following initial experiments supported the use of this assay (data not shown). Firstly, regardless of cellular oxidative stresses or H2O2 addition after cell lysis, in the absence of alkylating agents, if PTEN immunoprecipitates were washed and assayed in reducing conditions, the same activity was recovered as control samples, indicating that in these experiments oxidation is reversible. Secondly, if IAA was included in a reducing lysis buffer (5 mM DTT), no detectable activity was recovered, indicating alkylation. However, if IAA was included in an oxidizing lysis buffer (1 mM H2O2), and immunoprecipitated enzyme was later reduced in the absence of IAA, substantial activity was recovered, indicating that reversible oxidation can protect PTEN from alkylation. Figure 2.Cellular PTEN is inactivated by oxidative stress. (A) The indirect alkylation method used to analyse the effects of oxidative stress on PTEN activity is shown. It is described in detail in the text and Materials and methods. Iodoacetic acid is abbreviated to IAA and immunoprecipitation to IP. The method causes PTEN that is oxidized and inactive at the moment of lysis to be recovered as activity. Reduced active cellular enzyme is alkylated and this activity is lost. This method is used in panel B. (B) For indirect redox analysis of PTEN, Swiss 3T3 cells were treated for 10 min with the indicated concentrations of H2O2 before being lysed in buffer containing the alkylating agent IAA. PTEN was immunoprecipitated and IAA washed away before PTEN was assayed in reducing conditions. Control cells were also lysed in buffer lacking alkylating agent, but with 5 mM DTT reducing agent and immunoprecipitated, washed and assayed in reducing conditions. A fraction of the first sample from each condition was analysed by western blotting (WB) using a different antibody raised against PTEN. (C) Direct analysis of PTEN activity. Swiss 3T3 cells were treated with or without 1 mM H2O2 for 10 min. Cells were then lysed, and endogenous PTEN was then immunoprecipitated and assayed, all in anaerobic conditions in the absence of additional reducing or oxidizing agents. As a positive control 5 μg of alkaline phosphatase (AP) was used. A fraction of each PTEN IP sample was analysed by western blotting using a different antibody raised against PTEN. Data is presented as mean activity (d.p.m. released phosphate) from duplicate samples ± the range of these duplicates, with the exception of the PTEN IPs from (C) which are derived from triplicate samples. Download figure Download PowerPoint We applied this assay initially to analyse the oxidation of endogenous PTEN in cultured Swiss 3T3 fibroblasts exposed to oxidative stress induced by H2O2. In these experiments, very little PTEN activity was recovered from control cells in normal medium, indicating that most of the enzyme was in the reduced (active) state and was alkylated by IAA upon cell lysis. However, 1 mM H2O2 added to the medium was found to protect almost all cellular PTEN from alkylation, and allow its later recovery as active enzyme, indicating that PTEN was mostly oxidized in these cellular conditions (Figure 2B). In further analyses of the sensitivity of PTEN to exogenous H2O2, a steep response curve was evident, with a 10 min incubation in 1 mM H2O2 protecting most cellular PTEN from alkylation, whilst the protection induced by 100 μM H2O2 was barely detectable (Figure 2B). These experiments consistently showed a small decrease in the electrophoretic mobility of PTEN from lysates treated with IAA. It seems likely that this represents alkylation of the free cysteine residues of PTEN, as PTEN contains 10 cysteines including C71 and C124, and the gradient gels used are able to detect mobility differences of several hundred Daltons. As a verification of the results from this indirect analysis of PTEN oxidative inactivation, cellular PTEN activity was immunoprecipitated and assayed under anaerobic conditions in the absence of additional reducing or oxidizing agents. This work showed that robust PTEN activity could be recovered in these conditions and that this activity was almost completely abolished by treatment of cells with 1 mM H2O2 for 10 min (Figure 2C). This result agrees closely with that found through oxidative protection from alkylation of PTEN (Figure 2B), and strongly validates the adapted method of Meng et al. (2002). The activation of the PI 3-kinase pathway by oxidative stress requires PTEN We have shown that PTEN can be inactivated by oxidative stress. In order to investigate whether this inactivation leads to an activation of downstream PI 3-kinase-dependent signalling, we chose first to analyse cellular phosphoinositide lipid levels. Therefore, we investigated the effects of oxidative stress on the levels of PtdIns(3,4,5)P3 and PtdIns(3,4)P2 in the PTEN-null glioblastoma cell line U87MG, with and without exogenous expression of wild-type PTEN (Figure 3A and C), or with expression of wild-type PTEN, or phosphatase-dead PTEN C124S (Figure 3B), using a viral delivery system. Cells were also treated with and without platelet-derived growth factor (PDGF), which is known to cause a strong activation of PI 3-kinase in these cells. These experiments showed, as would be expected, that in the absence of H2O2, wild-type PTEN expression reduced PtdIns(3,4,5)P3 levels. How ever, in all cases, the PtdIns(3,4,5)P3 levels of cells exposed to 1 mM H2O2 was similar in cells expressing wild-type PTEN compared with those lacking the enzyme activity, suggesting that H2O2 treatment oxidizes and inactivates any expressed PTEN. Most significantly however, these data also showed that in cells expressing PTEN, exposure to H2O2 led to a 3–4 fold increase in the levels of basal PtdIns(3,4,5)P3, whereas in cells lacking PTEN activity, exposure to H2O2 did not significantly change PtdIns(3,4,5)P3 levels. This strongly suggests that the principle mechanism of H2O2-induced PtdIns(3,4,5)P3 increase, is through oxidative inhibition of PTEN. In contrast, levels of PtdIns(3,4)P2 were greatly increased by oxidative stress regardless of cellular PTEN status. This suggests that other targets of oxidative stress exist that can regulate levels of this lipid, perhaps other oxidant sensitive PtdIns(3,4)P2 phosphatases. Figure 3.Oxidative stress increases cellular PtdIns(3,4,5)P3 levels only in cells expressing wild-type PTEN. Cellular levels of PtdIns(3,4,5)P3 (A and B) and PtdIns(3,4)P2 (C) were analysed in U87MG cells ± PTEN activity, stimulated with PDGF and/or H2O2. PTEN-null U87MG cells were labelled with [3H]inositol for 48 h in inositol-free culture medium. For the last 24 h of this incubation, cells were either left uninfected or infected with virus expressing wild-type GFP–PTEN (A and C), or infected with viruses expressing phosphatase-dead GFP–PTEN C124S or wild-type GFP–PTEN (B). Some cells were then stimulated as shown with 1 mM H2O2 or 50 ng/ml PDGF for 10 min before lysis. Cellular phosphoinositides were then purified, deacylated and analysed by HPLC. Data are presented as the mean of duplicate samples plus the range of these duplicates, with data for (A) and (C) being derived from the one experiment. These experiments were performed three times with similar results. The percentage of label incorporated into each lipid in unstimulated uninfected or C124S-infected cells corresponds to 1641, 1317 and 1462 d.p.m. above background in (A), (B) and (C), respectively. Download figure Download PowerPoint To further analyse the activation of downstream PI 3-kinase-dependent signalling by oxidative stress, experiments were conducted investigating the activity and phosphorylation of the PtdIns(3,4,5)P3-dependent kinase, protein kinase B (PKB, also known as Akt) in the presence and absence of PTEN. These experiments showed that as with the PtdIns(3,4,5)P3 measurements, in cells lacking PTEN, PKB activity was not increased by oxidative stress, but was increased by PDGF. When PTEN was expressed in these cells, oxidative stress was then able to cause a substantial increase in PKB activity (Figure 4). In these experiments, a small decrease in PKB serine 473 phosphorylation was seen in response to H2O2 treatment, although a similar effect was not clearly evident in PKB kinase activity and its significance is unclear. These data indicate that oxidative stress is able to activate PKB only in cells expressing PTEN and therefore that this activation is mediated at least in part through oxidative inactivation of this phosphatase. Figure 4.Oxidative stress activates cellular PKB only in cells expressing PTEN. PTEN-null U87MG cells growing at low cell density were either left uninfected or infected with viruses encoding wild-type GFP–PTEN for 24 h. Cells were then stimulated with 1 mM H2O2 or 50 ng/ml PDGF for 10 min before cell lysis and determination of the activity (A) and phosphorylation (B) of PKB/Akt. (A) After lysis, cellular PKB was immunoprecipitated and assayed in vitro. Data is presented as the mean + SD d.p.m. of labelled phosphate incorporated into peptide substrate from triplicate samples. (B) After lysis, the phosphorylation of PKB was analysed by western blotting using antibodies specific for total PKB and for phosphoserine-473 PKB. These experiments were performed three times with similar results. Download figure Download PowerPoint These data show by two distinct approaches, that cellular PTEN is inactivated by oxidative stress. Additionally, analysis of PtdIns(3,4,5)P3 levels and downstream signalling are consistent with the oxidative inactivation of PTEN and indicate that oxidative stress increases PtdIns(3,4,5)P3 levels and activates downstream signalling only in cells that express PTEN. This indicates that oxidative stress is able to regulate PI 3-kinase-dependent signalling through inactivation of PTEN. Physiological redox regulation of PTEN in macrophages It has become clear that H2O2 and other ROS are produced endogenously in many cell types in diverse processes (Finkel, 2000; Droge, 2002). It has also been proposed that ROS are active cellular signalling molecules (Finkel, 1998, 2000). In order to investigate the possibility that PTEN is inactivated by the endogenous production of ROS, we performed an analysis in the murine macrophage cell line, RAW264.7, in which the stimulated production of H2O2 and other ROS by the phagocytic NADPH oxidase complex has been well studied (Ahmed et al., 1997; Brune et al., 1997; Han et al., 2001; Pfeiffer et al., 2001). Significantly, it is known that the phagocytic NADPH oxidase complex can be activated by PtdIns(3,4,5)P3-dependent signals (Babior, 1999; Welch et al., 2002). This potential co-localization of the substrate of PTEN with an oxidant producing complex suggests a possible model for the localized inhibition of PTEN protecting a functionally significant pool of PtdIns(3,4,5)P3. In RAW macrophages, the acute stimulation of oxidant production by lipopolysaccharide (LPS) and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) has been described (Ahmed et al., 1997; Brune et al., 1997; Pfeiffer et al., 2001). It has also been shown that LPS treatment leads to the activation of the PtdIns(3,4,5)P3-regulated kinase PKB/Akt (Salh et al., 1998; Monick et al., 2001). Using the oxidant-sensitive fluorophore dichlorofluorescin diacetate, we were able to verify that LPS or PMA, but not insulin, rapidly induced the production of cellular oxidants in RAW264.7 macrophages (data not shown). Therefore, we investigated the oxidation of PTEN in RAW macrophages using the method described above and in Figure 2A. These experiments established that combined stimulation with LPS and PMA for 10 or 30 min induced a significant increase in the fraction of endogenous cellular PTEN protected from experimental alkylation. This was the case in cells both with and without 24 h priming with interferon γ (Figure 5A and B). The reliance of this effect upon cellular oxidant production was investigated using the cell permeant antioxidant N-acetyl cysteine (NAC, 10 mM) and a frequently used inhibitor of NADPH oxidase, diphenyleneiodonium chloride (DPI, 10 μM). Both NAC and DPI interfered with the protection of PTEN from alkylation, again indicating that this reflects oxidation (Figure 5D). Since stimulation did not affect the recovered activity of PTEN in reducing conditions (Figure 5C), these data indicate that these stimuli caused the oxidation and inactivation of a fraction of cellular PTEN that correlated with increased downstream signalling, indicated by phosphorylation of PKB (Figure 5E). The data correspond to an increase in the oxidized inactive fraction of cellular PTEN from ∼5% in unstimulated cells to ∼16% in cells stimulated for 10 min. We also found that stimulation with LPS or PMA alone appeared to result in a rise in the oxidized fraction of cellular PTEN, although this increase was not always statistically significant (LPS, 0 out of 2 experiments significant, PMA 1 out of 2) (data not shown). H2O2 (1 mM) was also found to lead to the oxidation of most cellular PTEN, and substantially to activate PKB in RAW macrophages (data not shown and Figure 6). We also assessed the oxidation of PTEN directly using a method previously used to analyse the p53 protein (Wu and Momand, 1998; Seo et al., 2002) that relies upon an initial cysteine-directed alkylation of proteins in a cell lysate, subsequent reduction, and second treatment with a biotinlyated alkylating agent. This allows the analysis of cysteine residues that were protected in an oxidized form in the initial lysate. This method also showed that in the RAW264.7 macrophages, H2O2 treatment and to a lesser extent stimulation with LPS and PMA lead to a substantial detection of oxidized PTEN (Figure 5F). Figure 5.Inactivation of cellular PTEN by stimulation of RAW264.7 macrophages. RAW264.7 macrophages were either grown in normal medium (A), or primed with 100 ng/ml interferon γ for 24 h (B), before some cells were stimulated with 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA for the indicated times. Cellular PTEN was then immunoprecipitated in the presence of the alkylating agent IAA (as Figure 2A and B), and the fraction of cellular PTEN protected from alkylation by oxidation was determined. Data in (A) are presented as the mean of five samples ± the SEM. This experiment was performed three times with similar results. Data in (B) are presented as the mean of six samples ± SEM. This experiment was performed on three occasions with similar results. In (A) and (B), the mean fully reduced control PTEN activity were 3362 and 5515 d.p.m. respectively. (C) RAW264.7 macrophages were also stimulated for 10 min with 100 ng/ml LPS alone or 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA, and subsequently cells were lysed and PTEN immunoprecipitated and assayed all in reducing conditions in the absence of alkylating agents. (D) The oxidant dependence of the protection of PTEN from alkylation in stimulated macrophages (as panel A) was investigated. The stimulated production of ROS in RAW macrophages was antagonized by a 5 min pre-treatment with either 10 μM DPI or 10 mM NAC before stimulation with 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA for 10 min. Cells were then lysed and the protection of PTEN from alkylation was investigated as above (Figures 2 and 5A and B). Data are presented as the mean of three samples ± SEM. (E) PKB phosphorylation in lysates used for the investigation of the oxidation of cellular PTEN (see panels A and B) was analysed in duplicate samples by Western blotting using antibodies specific for phosphoserine-473 PKB and total PKB. The presence of the alkylating agent IAA in the lysis buffer did not appear to interfere with this analysis. (F) The oxidation of PTEN was analysed using a biotinlyated alkylating agent as described in Materials and methods. RAW264.7 macrophages were treated with or without either 1 mM H2O2 or with 100 ng/ml LPS and 1 μM PMA. Cells were lysed in the presence of alkylating agent and proteins sequentially reduced and alkyated with a second biotinylated alkylating agent. PTEN was then immunoprecipitated and analysed either by western blotting with different antibodies against the protein, or with streptavidin–HRP. Download figure Download PowerPoint Figure 6.Stimulation of RAW264.7 macrophages induces an oxidant-dependent activation of PKB. RAW264.7 macrophages were left untreated (−) or pre-treated for 5 min with 10 mM NAC (N) or DPI (D). Cells were then left untreated (control) or stimulated with 100 ng/ml LPS, 1 μM PMA, 10 μM insulin or 1 mM H2O2, each for 10 min. Cells were lysed and the activity state of cellular PKB was analysed using an in vitro kinase assay of immunoprecipitated PKB (A), or PKB phosphorylation analysed using western blotting with antibodies specific for phosphoserine-473 PKB, total PKB and PTEN (B). Data in (A) are presented as the mean activity ± SEM from a minimum of three samples. These experiments were performed three times with similar results. Download figure Download PowerPoint Experiments measuring PtdIns(3,4,5)P3 levels in RAW macrophages proved unsuccessful, as levels of this lipid appeared to be unusually low (<0.001% of that of phosphatidylinositol in pilot experiments, N.Leslie and S.Safrany unpublished data). Therefore, PKB activation was analysed in these cells, and the reliance of this activation upon oxidant production investigated using NAC and DPI, as described above. Pilot experiments showed that in comparison with other cell types RAW cells express PKBγ and low levels of PKBα that can be activated by cellular stimulation with a number of stimuli including LPS, PMA, interferon γ, H2O2 and insulin, the latter possibly acting through an IGF1 receptor. While stimulation with LPS, PMA or insulin all increased cellular PKB activity several fold, the activation by LPS and PMA was significantly inhibited by either NAC or DPI, indicating a requirement for cellular oxidant production in the activation of PKB by these stimuli (Figure 6). In contrast, the activation of PKB by insulin was not significantly affected. These data suggest that LPS and PMA both activate PKB by an oxidant-dependent mechanism, but insulin does so by an oxidant-independent pathway. The extent of the oxidant-independent activation of PKB might be expected to indicate the relative importance of stim

The antiviral restriction factor, tetherin, blocks the release of several different families of enveloped viruses, including the Coronaviridae. Tetherin is an interferon-induced protein that forms parallel homodimers between the host cell and viral particles, linking viruses to the surface of infected cells and inhibiting their release. We demonstrated that SARS-CoV-2 infection causes tetherin downregulation, and that tetherin depletion from cells enhances SARS-CoV-2 viral titres. We investigated the potential viral proteins involved in abrogating tetherin function and found that SARS-CoV-2 ORF3a reduces tetherin localisation within biosynthetic organelles via reduced retrograde recycling and increases tetherin localisation to late endocytic organelles. By removing tetherin from the Coronavirus budding compartments, ORF3a enhances virus release. We also found expression of Spike protein caused a reduction in cellular tetherin levels. Our results confirm that tetherin acts as a host restriction factor for SARS-CoV-2 and highlight the multiple distinct mechanisms by which SARS-CoV-2 subverts tetherin function.

Abstract Zika virus (ZIKV) is an emerging mosquito-borne flavivirus recently associated with congenital diseases and neurological complications. As for all flaviviruses, the ZIKV RNA genome is expected to encode a single polyprotein with all the enzymatic activities required for viral replication. Here, we report the discovery of multiple non-canonical open reading frames (ORFs) identified by ribosome profiling. In both mammalian and insect cells infected with Asian/American and African ZIKV strains, we observed translation of previously unrecognised upstream ORFs (uORFs) in the 5′ region. In the Asian/American ZIKV lineage, ribosomes translated uORF1 and uORF2 that initiated from non-AUG start codons, whereas in the African ZIKV lineage, these two uORFs were fused into a single uORF (African uORF). Using a reverse genetics system, we examined the impact on ZIKV fitness of the expression of single or dual uORFs by analysing a panel of mutant viruses. We found that expression of the African uORF, and more significantly, the Asian/American uORF1, modulated virus growth and tropism in human cortical neurons and 3D organoid tissue, indicating that these novel uORFs contribute to ZIKV neurotropism. Although ZIKV uORFs are expressed in mosquito cells, they did not have a detectable effect on transmission by the mosquito vector in vivo . Our discovery of ZIKV uORFs sheds new light on ZIKV-induced neuropathogenesis and raises the question of their existence in other neurotropic flaviviruses.

SUMMARY The SARS-CoV-2 genome encodes a multitude of accessory proteins. Using comparative genomic approaches, an additional accessory protein, ORF3c, has been predicted to be encoded within the ORF3a sgmRNA. Expression of ORF3c during infection has been confirmed independently by ribosome profiling. Despite ORF3c also being present in the 2002-2003 SARS-CoV, its function has remained unexplored. Here we show that ORF3c localises to mitochondria during infection, where it inhibits innate immunity by restricting IFN-β production, but not NF-κB activation or JAK-STAT signalling downstream of type I IFN stimulation. We find that ORF3c acts after stimulation with cytoplasmic RNA helicases RIG-I or MDA5 or adaptor protein MAVS, but not after TRIF, TBK1 or phospho-IRF3 stimulation. ORF3c co-immunoprecipitates with the antiviral proteins MAVS and PGAM5 and induces MAVS cleavage by caspase-3. Together, these data provide insight into an uncharacterised mechanism of innate immune evasion by this important human pathogen.

Abstract Despite being the target of extensive research efforts due to the COVID-19 pandemic, relatively little is known about the dynamics of SARS-CoV-2 replication within cells. We investigate and characterise the tightly orchestrated sequence of events during different stages of the infection cycle by visualising the spatiotemporal dynamics of the four structural proteins of SARS-CoV-2 at high resolution. The nucleoprotein is expressed first and accumulates around folded ER membranes in convoluted layers that connect to viral RNA replication foci. We find that of the three transmembrane proteins, the membrane protein appears at the Golgi apparatus/ERGIC before the spike and envelope proteins. Relocation of the lysosome marker LAMP1 towards the assembly compartment and its detection in transport vesicles of viral proteins confirm an important role of lysosomes in SARS-CoV-2 egress. These data provide new insights into the spatiotemporal regulation of SARS-CoV-2 assembly, and refine current understanding of SARS-CoV-2 replication.

Abstract The genus Torovirus (subfamily Torovirinae , family Coronaviridae , order Nidovirales ) encompasses a range of species that infect domestic ungulates including cattle, sheep, goats, pigs and horses, causing an acute self-limiting gastroenteritis. Using the prototype species equine torovirus (EToV) we performed parallel RNA sequencing (RNA-seq) and ribosome profiling (Ribo-seq) to analyse the relative expression levels of the known torovirus proteins and transcripts, chimaeric sequences produced via discontinuous RNA synthesis (a characteristic of the nidovirus replication cycle) and changes in host transcription and translation as a result of EToV infection. RNA sequencing confirmed that EToV utilises a unique combination of discontinuous and non-discontinuous RNA synthesis to produce its subgenomic RNAs; indeed, we identified transcripts arising from both mechanisms that would result in sgRNAs encoding the nucleocapsid. Our ribosome profiling analysis revealed that ribosomes efficiently translate two novel CUG-initiated ORFs, located within the so-called 5’ UTR. We have termed the resulting proteins U1 and U2. Comparative genomic analysis confirmed that these ORFs are conserved across all available torovirus sequences and the inferred amino acid sequences are subject to purifying selection, indicating that U1 and U2 are functionally relevant. This study provides the first high-resolution analysis of transcription and translation in this neglected group of livestock pathogens. Importance Toroviruses infect cattle, goats, pigs and horses worldwide and can cause gastrointestinal disease. There is no treatment or vaccine and their ability to spill over into humans has not been assessed. These viruses are related to important human pathogens including severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus and they share some common features, however the mechanism that they use to produce subgenomic RNA molecules differs. Here we performed deep sequencing to determine how equine torovirus produces subgenomic RNAs. In doing so, we also identified two previously unknown open reading frames “hidden” within the genome. Together these results highlight the similarities and differences between this domestic animal virus and related pathogens of humans and livestock.

ABSTRACT Encephalomyocarditis virus (EMCV) has for decades served as an important model RNA virus. Although most of the EMCV proteins are obtained via proteolytic cleavage of a long polyprotein, 2B* is expressed from a short overlapping open reading frame via an unusual protein-stimulated temporally dependent ribosomal frameshifting mechanism. The function of 2B* has not yet been characterised, though mutant viruses that are unable to express 2B* have a small plaque phenotype. Here we show that 2B* binds all seven members of the 14-3-3 protein family during virus infection. Binding is dependent on the 2B* C-terminal sequence RRNSS. IFN-β and IL-6 signalling are impeded following overexpression of 2B* but not a truncated version lacking the RRNSS residues, thus suggesting a 14-3-3-dependent role for 2B* in inhibiting MAVS signalling. We also find that this function is distinct from the effect of 2B* on plaque size, as a virus in which 2B* was similarly truncated exhibited near-wildtype plaque size, thus indicating that 2B* also harbours additional functions. This work provides the first identification of a role of 2B* in innate immune antagonism and expands our knowledge of the protein complement of this important model virus. IMPORTANCE Encephalomyocarditis virus (EMCV) infects a range of species, causing economically important reproductive disorders in pigs and encephalitis and myocarditis in rodents. Due to its wide host range, it is an important model pathogen for investigating virus-host interactions. EMCV expresses an accessory protein, 2B*, from an overlapping open reading frame via an unusual ribosomal frameshifting mechanism. Although the frameshifting mechanism has been established, the function of the 2B* protein had not previously been explored. Here, we determined the host proteins to which 2B* binds and found that it specifically binds to the entire 14-3-3 protein family which, among other roles, contribute to the innate immune response to viral infection in mammalian cells. This interaction requires a specific stretch of amino acids at the end of 2B*. By interacting with the 14-3-3 proteins, 2B* blocks immune response activation. Thus, 2B* is a novel antagonist of innate immunity.