The family Potyviridae includes >30% of known plant virus species, many of which are of great agricultural significance. These viruses have a positive sense RNA genome that is approximately 10 kb long and contains a single long ORF. The ORF is translated into a large polyprotein, which is cleaved into approximately 10 mature proteins. We report the discovery of a short ORF embedded within the P3 cistron of the polyprotein but translated in the +2 reading-frame. The ORF, termed pipo, is conserved and has a strong bioinformatic coding signature throughout the large and diverse Potyviridae family. Mutations that knock out expression of the PIPO protein in Turnip mosaic potyvirus but leave the polyprotein amino acid sequence unaltered are lethal to the virus. Immunoblotting with antisera raised against two nonoverlapping 14-aa antigens, derived from the PIPO amino acid sequence, reveals the expression of an approximately 25-kDa PIPO fusion product in planta. This is consistent with expression of PIPO as a P3-PIPO fusion product via ribosomal frameshifting or transcriptional slippage at a highly conserved G(1-2)A(6-7) motif at the 5' end of pipo. This discovery suggests that other short overlapping genes may remain hidden even in well studied virus genomes (as well as cellular organisms) and demonstrates the utility of the software package MLOGD as a tool for identifying such genes.

Influenza's Cryptic Constraint Because of the well-known pandemic potential of influenza viruses, it is important to understand the range of molecular interactions between the virus and its host. Despite years of intensive research on the virus, Jagger et al. (p. 199 , published online 28 June; see the Perspective by Yewdell and Ince ) have found that the influenza A virus has been hiding a gene in its small negative-sense RNA genome. An overlapping open reading frame was found contained in the PA viral RNA polymerase gene, which is accessed by ribosomal frameshifting to produce a fusion protein containing the N-terminal messenger RNA (mRNA) endonuclease domain of PA and an alternative C-terminal X domain. The resulting polypeptide, PA-X, selectively degrades host mRNAs and, in a mouse model of infection, modulated cellular immune responses, thus limiting viral pathogenesis.

The arterivirus family (order Nidovirales ) of single-stranded, positive-sense RNA viruses includes porcine respiratory and reproductive syndrome virus and equine arteritis virus (EAV). Their replicative enzymes are translated from their genomic RNA, while their seven structural proteins are encoded by a set of small, partially overlapping genes in the genomic 3′-proximal region. The latter are expressed via synthesis of a set of subgenomic mRNAs that, in general, are functionally monocistronic (except for a bicistronic mRNA encoding the E and GP2 proteins). ORF5, which encodes the major glycoprotein GP5, has been used extensively for phylogenetic analyses. However, an in-depth computational analysis now reveals the arterivirus-wide conservation of an additional AUG-initiated ORF, here termed ORF5a, that overlaps the 5′ end of ORF5. The pattern of substitutions across sequence alignments indicated that ORF5a is subject to functional constraints at the amino acid level, while an analysis of substitutions at synonymous sites in ORF5 revealed a greatly reduced frequency of substitution in the portion of ORF5 that is overlapped by ORF5a. The 43–64 aa ORF5a protein and GP5 are probably expressed from the same subgenomic mRNA, via a translation initiation mechanism involving leaky ribosomal scanning. Inactivation of ORF5a expression by reverse genetics yielded a severely crippled EAV mutant, which displayed lower titres and a tiny plaque phenotype. These defects, which could be partially complemented in ORF5a-expressing cells, indicate that the novel protein, which may be the eighth structural protein of arteriviruses, is expressed and important for arterivirus infection.

There are many methods for introducing random mutations into nucleic acid sequences. Previously, we described a suite of programmes for estimating the completeness and diversity of randomized DNA libraries generated by a number of these protocols. Our programmes suggested some empirical guidelines for library design; however, no information was provided regarding library diversity at the protein (rather than DNA) level. We have now updated our web server, enabling analysis of translated libraries constructed by site-saturation mutagenesis and error-prone PCR (epPCR). We introduce GLUE-Including Translation (GLUE-IT), which finds the expected amino acid completeness of libraries in which up to six codons have been independently varied (according to any user-specified randomization scheme). We provide two tools for assisting with experimental design: CodonCalculator, for assessing amino acids corresponding to given randomized codons; and AA-Calculator, for finding degenerate codons that encode user-specified sets of amino acids. We also present PEDEL-AA, which calculates amino acid statistics for libraries generated by epPCR. Input includes the parent sequence, overall mutation rate, library size, indel rates and a nucleotide mutation matrix. Output includes amino acid completeness and diversity statistics, and the number and length distribution of sequences truncated by premature termination codons. The web interfaces are available at http://guinevere.otago.ac.nz/stats.html .

Programmed −1 ribosomal frameshifting (−1 PRF) is a gene-expression mechanism used to express many viral and some cellular genes. In contrast, efficient natural utilization of −2 PRF has not been demonstrated previously in eukaryotic systems. Like all nidoviruses, members of the Arteriviridae (a family of positive-stranded RNA viruses) express their replicase polyproteins pp1a and pp1ab from two long ORFs (1a and 1b), where synthesis of pp1ab depends on −1 PRF. These polyproteins are posttranslationally cleaved into at least 13 functional nonstructural proteins. Here we report that porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), and apparently most other arteriviruses, use an additional PRF mechanism to access a conserved alternative ORF that overlaps the nsp2-encoding region of ORF1a in the +1 frame. We show here that this ORF is translated via −2 PRF at a conserved G_GUU_UUU sequence (underscores separate ORF1a codons) at an estimated efficiency of around 20%, yielding a transframe fusion (nsp2TF) with the N-terminal two thirds of nsp2. Expression of nsp2TF in PRRSV-infected cells was verified using specific Abs, and the site and direction of frameshifting were determined via mass spectrometric analysis of nsp2TF. Further, mutagenesis showed that the frameshift site and an unusual frameshift-stimulatory element (a conserved CCCANCUCC motif 11 nucleotides downstream) are required to direct efficient −2 PRF. Mutations preventing nsp2TF expression impair PRRSV replication and produce a small-plaque phenotype. Our findings demonstrate that −2 PRF is a functional gene-expression mechanism in eukaryotes and add another layer to the complexity of arterivirus genome expression.

Segment 7 of influenza A virus produces up to four mRNAs. Unspliced transcripts encode M1, spliced mRNA2 encodes the M2 ion channel, while protein products from spliced mRNAs 3 and 4 have not previously been identified. The M2 protein plays important roles in virus entry and assembly, and is a target for antiviral drugs and vaccination. Surprisingly, M2 is not essential for virus replication in a laboratory setting, although its loss attenuates the virus. To better understand how IAV might replicate without M2, we studied the reversion mechanism of an M2-null virus. Serial passage of a virus lacking the mRNA2 splice donor site identified a single nucleotide pseudoreverting mutation, which restored growth in cell culture and virulence in mice by upregulating mRNA4 synthesis rather than by reinstating mRNA2 production. We show that mRNA4 encodes a novel M2-related protein (designated M42) with an antigenically distinct ectodomain that can functionally replace M2 despite showing clear differences in intracellular localisation, being largely retained in the Golgi compartment. We also show that the expression of two distinct ion channel proteins is not unique to laboratory-adapted viruses but, most notably, was also a feature of the 1983 North American outbreak of H5N2 highly pathogenic avian influenza virus. In identifying a 14th influenza A polypeptide, our data reinforce the unexpectedly high coding capacity of the viral genome and have implications for virus evolution, as well as for understanding the role of M2 in the virus life cycle.

Members of the family Coronaviridae have the largest genomes of all RNA viruses, typically in the region of 30 kilobases. Several coronaviruses, such as Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus (SARS-CoV) and Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (MERS-CoV), are of medical importance, with high mortality rates and, in the case of SARS-CoV, significant pandemic potential. Other coronaviruses, such as Porcine epidemic diarrhea virus and Avian coronavirus, are important livestock pathogens. Ribosome profiling is a technique which exploits the capacity of the translating ribosome to protect around 30 nucleotides of mRNA from ribonuclease digestion. Ribosome-protected mRNA fragments are purified, subjected to deep sequencing and mapped back to the transcriptome to give a global "snap-shot" of translation. Parallel RNA sequencing allows normalization by transcript abundance. Here we apply ribosome profiling to cells infected with Murine coronavirus, mouse hepatitis virus, strain A59 (MHV-A59), a model coronavirus in the same genus as SARS-CoV and MERS-CoV. The data obtained allowed us to study the kinetics of virus transcription and translation with exquisite precision. We studied the timecourse of positive and negative-sense genomic and subgenomic viral RNA production and the relative translation efficiencies of the different virus ORFs. Virus mRNAs were not found to be translated more efficiently than host mRNAs; rather, virus translation dominates host translation at later time points due to high levels of virus transcripts. Triplet phasing of the profiling data allowed precise determination of translated reading frames and revealed several translated short open reading frames upstream of, or embedded within, known virus protein-coding regions. Ribosome pause sites were identified in the virus replicase polyprotein pp1a ORF and investigated experimentally. Contrary to expectations, ribosomes were not found to pause at the ribosomal frameshift site. To our knowledge this is the first application of ribosome profiling to an RNA virus.

Scientific Report25 June 2015Open Access Transcriptional slippage in the positive-sense RNA virus family Potyviridae Allan Olspert Allan Olspert Division of Virology, Department of Pathology, Addenbrooke's Hospital, University of Cambridge, Cambridge, UK Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Betty Y-W Chung Betty Y-W Chung Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author John F Atkins John F Atkins Schools of Biochemistry and Microbiology, University College Cork, Cork, Ireland Department of Human Genetics, University of Utah, Salt Lake City, UT, USA Search for more papers by this author John P Carr John P Carr Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Andrew E Firth Corresponding Author Andrew E Firth Division of Virology, Department of Pathology, Addenbrooke's Hospital, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Allan Olspert Allan Olspert Division of Virology, Department of Pathology, Addenbrooke's Hospital, University of Cambridge, Cambridge, UK Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Betty Y-W Chung Betty Y-W Chung Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author John F Atkins John F Atkins Schools of Biochemistry and Microbiology, University College Cork, Cork, Ireland Department of Human Genetics, University of Utah, Salt Lake City, UT, USA Search for more papers by this author John P Carr John P Carr Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Andrew E Firth Corresponding Author Andrew E Firth Division of Virology, Department of Pathology, Addenbrooke's Hospital, University of Cambridge, Cambridge, UK Search for more papers by this author Author Information Allan Olspert1,2, Betty Y-W Chung2, John F Atkins3,4, John P Carr2 and Andrew E Firth 1 1Division of Virology, Department of Pathology, Addenbrooke's Hospital, University of Cambridge, Cambridge, UK 2Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK 3Schools of Biochemistry and Microbiology, University College Cork, Cork, Ireland 4Department of Human Genetics, University of Utah, Salt Lake City, UT, USA *Corresponding author. Tel: +44 1223 762652; E-mail: [email protected] EMBO Reports (2015)16:995-1004https://doi.org/10.15252/embr.201540509 See also: KA White (August 2015) PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract The family Potyviridae encompasses ~30% of plant viruses and is responsible for significant economic losses worldwide. Recently, a small overlapping coding sequence, termed pipo, was found to be conserved in the genomes of all potyvirids. PIPO is expressed as part of a frameshift protein, P3N-PIPO, which is essential for virus cell-to-cell movement. However, the frameshift expression mechanism has hitherto remained unknown. Here, we demonstrate that transcriptional slippage, specific to the viral RNA polymerase, results in a population of transcripts with an additional “A” inserted within a highly conserved GAAAAAA sequence, thus enabling expression of P3N-PIPO. The slippage efficiency is ~2% in Turnip mosaic virus and slippage is inhibited by mutations in the GAAAAAA sequence. While utilization of transcriptional slippage is well known in negative-sense RNA viruses such as Ebola, mumps and measles, to our knowledge this is the first report of its widespread utilization for gene expression in positive-sense RNA viruses. Synopsis This study investigates the transframe expression mechanism of the recently identified potyviral movement protein, P3N-PIPO. While many positive-strand RNA viruses utilize translational frameshifting for gene expression, P3N-PIPO expression was found to depend on polymerase slippage. Compared to other potyviral proteins, P3N-PIPO is produced only in very small amounts. Slippage of the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) at a phylogenetically conserved GAAAAAA sequence leads to insertion of an additional “A” in 1–2% of viral transcripts. These edited transcripts encode the transframe P3N-PIPO protein. Introduction The family Potyviridae encompasses around 30% of known plant virus species and causes more than half of viral crop damage worldwide 12. The family comprises the genera Potyvirus, Rymovirus, Bymovirus, Ipomovirus, Tritimovirus, Macluravirus, Poacevirus and Brambyvirus, with genus Potyvirus containing the most species. Family members have single-stranded monopartite positive-sense RNA genomes except in the genus Bymovirus where the genome is bipartite. The genomic RNA has a covalently linked 5′-terminal protein (VPg) and a 3′ poly(A) tail. Subgenomic transcripts are not produced 3. Until recently, all the viral proteins were thought to be encoded within a single open reading frame (ORF) (or one ORF per segment in bymoviruses) that is translated as a polyprotein and cleaved to produce the mature virus proteins. However, it is now thought that all potyvirids contain an additional coding ORF, termed pipo, that overlaps the P3-encoding region of the polyprotein ORF in the −1/+2 reading frame (Fig 1) 4. PIPO is expressed as part of a larger product that was hypothesized to comprise the N-terminal part of P3 (termed P3N) fused to PIPO via either translational or transcriptional frameshifting 4. This hypothesis was further supported by the detection of products of appropriate sizes for P3 and P3N-PIPO with antibodies to N-terminal epitopes in P3 56. Frameshifting was proposed to occur at a GAA_AAA_A sequence (underscores separate polyprotein-frame codons) at the 5′ end of the pipo ORF that is highly conserved among Potyvirus species (Fig 1). Members of other Potyviridae genera have similar homopolymeric runs of “A”s at the same site (Appendix Dataset S1). The frameshift product P3N-PIPO plays an essential role in cell-to-cell movement, and mutations within this motif result in a movement-deficient phenotype 56789. Figure 1. Schematic of the TuMV genomeGFP is inserted between P1 and HC-Pro in the parent infectious clone (TuMV-GFP). Additionally, a V5 tag was inserted near the start of P3 to facilitate simultaneous detection of both P3 (zeroframe product) and P3N-PIPO (transframe product). The position of the conserved GAA_AAA_A sequence at the 5′ end of the pipo ORF is indicated. A WebLogo 56 representation of sequence conservation around the 5′ end of the pipo ORF for 99 genus Potyvirus NCBI RefSeqs aligned by amino acid sequence (see Appendix Dataset S1) is shown below. Download figure Download PowerPoint Many viruses utilize programmed ribosomal frameshifting (PRF) to direct a proportion of ribosomes into an alternative reading frame. In eukaryotic systems, efficient −1 PRF normally requires a “slippery” heptanucleotide sequence where the shift in reading frame takes place, and a 3′-adjacent stimulatory element which normally comprises an RNA stem-loop or pseudoknot structure separated from the slippery heptanucleotide by a “spacer” region of 5–9 nt 1011. The consensus motif for the slippery heptanucleotide is X_XXY_YYZ, where XXX normally represents any three identical nucleotides; YYY represents AAA or UUU; Z represents A, C or U; and spaces separate zero-frame codons 12. In the tandem slippage model, the P-site anticodon re-pairs from XXY to XXX, whereas the A-site anticodon re-pairs from YYZ to YYY, allowing for perfect re-pairing except at the wobble position 13. Because the codon:anticodon duplex in the P site is not monitored so strictly as that in the A site, certain deviations from the canonical XXX of the slippery site are tolerated, including GGU, GUU, GGA and GAA 101214. Frameshifting efficiency ranges from around 5–50%, depending on the particular system. In the absence of a 3′ stimulatory RNA structure, certain sequences can still support frameshifting to a level of potentially up to around 2% 12. In general, RNA structures typical of −1 PRF stimulatory elements are not predicted to form at an appropriate spacing downstream of the potyvirus GAA_AAA_A sequence. Nonetheless, this could still be consistent with −1 PRF if only a very low level of frameshifting were required, or if there were atypical stimulatory elements (e.g. nascent peptide, mRNA–rRNA interactions, RNA structure involving base-pairing with distal elements in the genome or trans-acting factors 15161718). More importantly, however, the GAA_AAA_A sequence is in a different frame from the −1 PRF X_XXY_YYZ shift site motif, making it inconsistent with the tandem −1 slippage model. On the other hand, around half of Potyvirus species have a “G” preceding the conserved GAA_AAA_A sequence (making a canonical −1 PRF shift site G_GAA_AAA), while one might propose that other species use −1 PRF but with little re-pairing in the P site. An alternative explanation is that frameshifting occurs at the transcriptional level. In several single-stranded negative-sense RNA viruses, such as members of the genus Ebolavirus and the sub-family Paramyxovirinae, the viral polymerase can stutter at a defined site to insert one or more additional nucleotides into a proportion of mRNA transcripts 19. Stuttering involves realignment between the template and nascent RNA strands in the polymerase and preferentially occurs on homopolymeric runs, especially those comprising “A”s or “U”s. In the paramyxoviruses, stuttering occurs on a 3′-UnCm-5′ (n + m ≥ 8) motif in the negative-sense template and results in the insertion of one or more additional “G”s in the positive-sense (5′-AnGm-3′) mRNA for the phosphoprotein gene. In paramyxoviruses, directionality is provided by the ability of RNA to form G:U pairs, but not A:C pairs. In ebolaviruses, stuttering occurs on a run of 7 “U”s in the negative-sense template to insert one or more additional “A”s in the positive-sense mRNA for the glyco-protein gene. However, transcriptional slippage was not considered an obvious explanation for pipo expression because of the short length of the conserved homopolymeric run (just 6 “A”s), and because the conserved 5′ “G” (resulting in a 3′-CU6-5′ sequence in the negative-sense template, opposite in orientation to the paramyxovirus 3′-UnCm-5′ stuttering site) appeared to favour nucleotide deletions over insertions, and two deletions (or one insertion) would be required to provide access to the pipo ORF. To resolve the conundrum of pipo expression, we engineered an infectious Turnip mosaic virus (TuMV; genus Potyvirus) clone to express epitope-tagged P3/P3N-PIPO and used it to assess frameshift-ing efficiency in the natural context of virus infection. We performed mutational analyses of the GAA_AAA_A sequence and investigated the mutant phenotypes. Finally, we performed high-throughput sequencing of RNA derived from virus infections. We found that an extra “A” is inserted into the GA6 sequence in approximately 2% of TuMV transcripts, thus enabling expression of P3N-PIPO. Comparable editing frequencies (0.8–1.3%) were observed for two other potyviruses. Results and Discussion P3N-PIPO is expressed at very low levels in TuMV-infected plants To investigate the potyvirus frameshifting mechanism, we used a GFP-expressing infectious clone of TuMV (TuMV-GFP; Fig 1). To enable efficient detection of both P3 and P3N-PIPO with the same antibody, we inserted a sequence encoding the V5 epitope to tag both the P3 and P3N-PIPO proteins near to their N-termini (Fig 1). The V5 tag was stably maintained within the virus genome for at least four passages. Using a V5 antibody, it was possible to detect both P3 and P3N-PIPO in protein extracts from upper leaves of plants following inoculation of lower leaves with TuMV-GFP via agroinfiltration (Fig 2). P3 was detectable in the early stages of systemic infection (around 5 days post-inoculation [d.p.i.]) and accumulated over time as expected. For the detection of P3N-PIPO, very concentrated protein samples (near lane overloading) were required and P3N-PIPO became detectable in minute quantities only at later timepoints (around 6 d.p.i.; see also Fig 3C for 21 d.p.i.), presumably after the virus had spread and accumulated within systemically infected leaves. Due to the massive differences in P3 and P3N-PIPO quantities, and rather poor detection of the latter, the frameshifting efficiency could not be determined reliably using Western analysis. Nonetheless, these experiments demonstrated that P3N-PIPO is produced only in very small amounts relative to the non-frameshift product P3. Figure 2. Detection of V5-tagged P3 and P3N-PIPOTotal protein extracts from upper leaves of Nicotiana benthamiana plants agroinfiltrated with TuMV-GFP or mock-infiltrated were collected 4–6 d.p.i. Proteins were separated by SDS–PAGE, blotted and probed with V5 antibody. Bands corresponding to the theoretical size of tagged P3 (41.7 kDa) and P3N-PIPO (26.5 kDa) are indicated with arrowheads, visible in the “infected” lane at 6 d.p.i. Ponceau S staining of nitrocellulose membrane-bound RuBisCO large subunit (RuBP-L) was used as a loading control. Download figure Download PowerPoint Figure 3. Analysis of TuMV mutants Sequences of slip site mutants. The highly conserved GAA_AAA_A (underlined) and flanking sequence in TuMV is shown at the top (WT). Spaces separate P3-frame codons. Theoretical translations in the 0 and −1/+2 frames are shown. Slip site mutants M1, M2, P and FSko are shown below with mutated nucleotides shown in red. All mutations leave the P3 amino acid sequence unaltered. Analysis of the ability to establish systemic infection. Nicotiana benthamiana plants were biolistically inoculated with WT or mutant (M1, M2, P, FSko) V5-tagged TuMV-GFP. Infection was monitored via GFP fluorescence under UV light at 5, 7 and 9 d.p.i. Western blot and RT–PCR analysis of upper leaves of inoculated plants. Total protein extracts (21 d.p.i.) were probed with CP and V5 antibodies. Ponceau S staining of RuBisCO large subunit (RuBP-L) was used as a loading control. For RT–PCR, TuMV-specific primers were used for detection of positive-strand viral RNA. Analysis of cell-to-cell movement. Confocal microscopy of biolistically inoculated leaves at 6 d.p.i. Scale bar = 25 μm. Download figure Download PowerPoint Genetic analysis indicates that −1 ribosomal frameshifting is not the primary expression mechanism for P3N-PIPO in TuMV A highly conserved GAA_AAA_A sequence at the 5′ end of the pipo ORF was proposed previously to be the site of frameshifting 4 (Fig 1). In TuMV, the motif is preceded by a “G”, to form a G_GAA_AAA_A sequence that might be compatible with −1 PRF to access the pipo ORF (Fig 3A). On the other hand, conservation of the final “A” would not be relevant for −1 tandem slippage PRF but would be relevant for transcriptional slippage. To further elucidate the frameshifting mechanism, several mutants were constructed (Fig 3A). Mutants M1 and M2 carry mutations 5′-adjacent to the GAA_AAA_A sequence that are expected to inhibit possible −1 PRF by preventing P-site codon:anticodon re-pairing following a −1 shift. Mutant P has mutations at the 3′ end of the GAA_AAA_A sequence that are expected to inhibit possible transcriptional slippage by reducing the length of the homopolymeric run of “A”s. Mutant FSko has mutations in the middle of the GAA_AAA_A sequence that should inhibit frameshifting by either mechanism. All the mutations listed above were introduced into the TuMV-GFP cDNA with V5-tagged P3 (denoted WT) and do not change the P3 amino acid sequence. Nicotiana benthamiana plants were biolistically inoculated with WT and mutant virus clones and virus infection monitored using GFP fluorescence (Fig 3B). As P3N-PIPO is required for virus movement, changes in its expression would be expected to manifest in an absence of movement or altered movement dynamics. In plants infected with WT virus, systemic infection was detected by 7 d.p.i. with GFP fluorescence detected in small clusters in the upper leaves. By 9 d.p.i., GFP fluorescence was seen over the entire leaf area of the upper leaves. Both mutants in which possible −1 PRF was inhibited, M1 and M2, behaved similarly to WT virus. In both cases, GFP fluorescence was detectable by 7 d.p.i. and reached maximum area by 9 d.p.i. In contrast, no GFP signal was detected in plants inoculated with mutant P, in which possible transcriptional slippage was inhibited, or mutant FSko, in which any type of frameshifting should be inhibited. The plants were monitored until 28 d.p.i. without any qualitative change being observable. Over two series of experiments, with 12 and 6 plants per construct, the percentages of systemic infection were as follows: WT, 75–100%; M1, 83–100%; M2, 83–100%; P, 0%; and FSko, 0%. Upper leaves of inoculated plants were also analysed for systemic infection using Western analysis and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT–PCR) (Fig 3C). Coat protein (CP), P3 and P3N-PIPO were detected in plants inoculated with WT and mutants M1 and M2, but, as expected based on the previous results, these proteins were absent from plants inoculated with mutants P and FSko. Using RT–PCR, viral RNA was detected in plants inoculated with WT and mutants M1 and M2, but not in plants inoculated with mutants P and FSko. The cDNA fragments obtained from plants inoculated with M1 and M2 were sequenced, and no reversions were detected at the mutated sites. Virus movement was monitored in inoculated leaves by confocal microscopy (Fig 3D). For WT virus, GFP fluorescence became easily detectable from 4 to 5 d.p.i. in clusters of cells, indicating virus cell-to-cell movement. Cell clusters typically reached approximately maximum size and signal intensity by day 6. Similar cell-to-cell movement was seen with mutants M1 and M2. In contrast, with mutants P and FSko, GFP fluorescence was only detected in single cells, indicating loss of cell-to-cell movement. Thus, inhibiting the potential for transcriptional slippage at the GAA_AAA_A site resulted in a movement-deficient phenotype, probably due to no or insufficient expression of P3N-PIPO. Conversely, these experiments indicate that −1 PRF is either not used for P3N-PIPO expression in TuMV or, if it does occur at some level, it is not the primary expression mechanism. To ensure that the movement-deficient phenotype of P and FSko was not simply an artefact of defective virus replication (with GFP fluorescence observed in single cells resulting from translation of RNA transcribed directly from the plasmid), these mutants were tested for their ability to replicate within cells. Mutants were introduced into plants by agroinfiltration (Fig 4). A replication-deficient TuMV-GFP clone, ∆GDD, lacking the catalytic GDD site of the viral polymerase, was constructed and used as a control. Using strand-specific RT–PCR, the positive-strand viral RNA (derived from T-DNA transcription and/or viral replication) was, as expected, detected with all constructs: ∆GDD, WT, P and FSko. However, when strand-specific RT–PCR was used to detect the negative-strand viral RNA, which can only be produced by the viral polymerase during viral replication, cDNA fragments were detected only for WT, P and FSko, indicating that mutants P and FSko are replication competent. Viral protein accumulation was also analysed. P3 and CP were detected by Western analysis in total protein extracts from patches infiltrated with ∆GDD, WT, P and FSko. Comparison of protein levels indicated that mutants P and FSko do not accumulate as efficiently as WT virus, though this might be an artefact of the assay as WT virus would reach more cells whereas the movement-deficient mutants would only replicate and accumulate in transformed cells. As expected, much lower levels of P3 and CP were detected in patches infiltrated with the ∆GDD mutant, consistent with transcription and translation of the T-DNA encoded sequence, without viral replication. In summary, the mutants unable to move from cell to cell (P and FSko) are still able to replicate and accumulate, supporting the proposition that the movement-compromised phenotype results from the absence or insufficient expression of P3N-PIPO. Figure 4. Replication of movement-deficient mutantsNicotiana benthamiana plants were agroinfiltrated with full-length WT and mutant viral clones. A replication-deficient mutant, ∆GDD, was used as a negative control. At 6 d.p.i., total RNA and protein were extracted from infiltrated patches. Virus replication was detected with strand-specific RT–PCR. Ethidium bromide staining of 28S rRNA was used as a control for RNA quality. Protein extracts were analysed by Western blot for the presence of CP and P3 (V5 epitope). Ponceau S staining of RuBisCO large subunit (RuBP-L) was used as a loading control. Download figure Download PowerPoint High-throughput sequencing reveals transcriptional slippage at the GA6 site To further test whether transcriptional slippage might explain P3N-PIPO production, we performed high-throughput sequencing of the slip site region in the context of virus infection. RNA was extracted from systemically infected leaves (total RNA), as well as from virions and polysomes. Primers designed to anneal just upstream or downstream of the GA6 sequence were used to reverse transcribe and amplify a region surrounding the GA6 site, and the resulting cDNAs were subjected to high-throughput sequencing (Fig 5, Appendix Table S1). Around 1.9–2.1% of reads obtained from total RNA purified from WT TuMV systemically infected leaves contained a single “A” insertion within the GA6 sequence (GA6 changed to GA7), thus allowing expression of P3N-PIPO at a level of ~2%, consistent with Western blots of V5-tagged virus (Fig 2). A single “A” insertion was the most abundant insertion/deletion event detected. Similar results were obtained with TuMV mutants M1 and M2, with 2.3–1.8% of reads containing a single “A” insertion. Polysomal and virion RNA (both purified from WT TuMV systemically infected leaves) were also tested. For polysomal RNA, a single “A” insertion was seen in 2.9% of reads, while, for virion-derived RNA, a single “A” insertion was seen in 2.1–2.5% of reads. Due to the movement-deficient phenotype of mutants P and FSko, RNA from agroinfiltrated patches was used to test for slippage, with insertions detected in ≤0.01% of reads. No insertions were observed when using plasmid DNA as template for library preparation, although deletions occurred at a low level (0.02–0.03%). Thus, insertions were not introduced during amplification, library preparation or sequencing. Figure 5. Transcriptional slippage at the GA6 sequenceLibraries were prepared and subjected to high-throughput sequencing in order to detect low-frequency insertion/deletion events. All samples apart from Ubi E2, eIF5B-1, eIF5B-2, BCMV and BCMNV correspond to TuMV. RNA was purified from upper leaves of systemically infected plants for samples TuMV WT, TuMV M1, TuMV M2, BCMV and BCMNV. Polysomes and virions were also purified from upper leaves of TuMV-infected plants. RNA from agroinfiltrated tissue was used for the TuMV P, FSko and ∆GDD mutants. Additionally, T7 in vitro transcribed RNA (T7 transc.) and plasmid DNA (DNA) were analysed. Three GA6 sequences in host genes—Ubi E2, eIF5B-1 and eIF5B-2—were also analysed. For each sample, frequencies of transcripts with an “A” insertion at the GA6 sequence are shown in blue; frequencies of transcripts with two or more inserted “A” nucleotides are shown in orange; and frequencies of transcripts with one or more “A” nucleotides deleted are in yellow. Download figure Download PowerPoint To test whether transcriptional slippage was specific to the viral polymerase, we also tested RNAs transcribed by host cell RNA polymerase. Samples from leaf patches agroinfiltrated with the ∆GDD TuMV mutant were analysed using the same primers as above. In these samples, TuMV RNA is transcribed by N. benthamiana RNA polymerase II from T-DNA, although it is conceivable that some transcripts produced in infiltrated A. tumefaciens cells may also be present. Prior to reverse transcription, samples were excessively treated with DNase and complete elimination of contaminating DNA verified by PCR. Insertion of a single “A” at the GA6 site occurred at a level of 0.05–0.07% in these samples—around 33-fold lower than was seen with WT TuMV. Two host genes containing GA6G sequences (similar to TuMV) were also tested: ubiquitin-conjugating enzyme E2 (Ubi E2) and eukaryotic translation initiation factor 5B (eIF5B). For eIF5B, two distinct GA6 sites were tested. In two of the three cases, insertion of an additional “A” at the GA6 site occurred at a level of 0.05–0.07% (around 33-fold below WT TuMV), while the third site was more slip-prone, with “A” insertions occurring at a level of 0.20–0.25% (around 9-fold below WT TuMV). In addition to testing specificity of higher levels of slippage to the viral polymerase, these experiments also put upper bounds on slippage introduced during reverse transcription. In contrast, the TuMV WT deletion rate (0.13–0.15%) was similar to that of the ΔGDD control (0.12–0.14%), indicating that pipo-site deletions are not specific to the viral polymerase. To test whether insertions were specific to the pipo slip site, total RNA from systemically infected leaves and virion-derived RNA were subjected to high-throughput sequencing (ENA databank accession PRJEB9490). Similar to before, single-nucleotide insertions at the GA6 sequence were observed at a level of 1.9 and 2.1% for total and virion RNA, respectively. Elsewhere in the TuMV genome, an average insertion rate of 0.001% per nucleotide was seen with both samples and no other insertion “hotspots” were detected of similar magnitude to the pipo slip site (Appendix Fig S1). While investigating translational frameshifting as a potential P3N-PIPO expression mechanism, we had previously performed in vitro translations of reporter constructs containing the pipo slip site and flanking sequences. We observed expression of both alternative frames with access to the pipo reading frame occurring at a level of 1.5–2.1% for WT sequence (Appendix Fig S2). In view of the above results, we decided to test whether slippage in the in vitro system might also be occurring at the level of transcription. We subjected cDNAs derived from T7-transcribed transcripts to high-throughput sequencing and found that 2.8% of transcripts had an “A” insertion in the GA6 sequence, while 0.5% of transcripts had deletions at the same site (Appendix Table S1). Thus, the in vitro frameshift products may be presumed to result from slippage by the T7 polymerase. The M1 and M2 mutations had little effect on expression of the frameshift products in vitro while the P mutation inhibited their production. To confirm that transcriptional slippage was not specific to TuMV, we analysed RNA from plants infected with two other potyviruses, Bean common mosaic virus (BCMV; aug_GAA_AAA_Auc slip site) and Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV; ucg_GAA_AAA_Auu slip site). In these species, insertion of a single “A” at the GA6 sequence occurred at a level of 1.3% and 0.8%, respectively, and in both an elevated level of deletions was observed in comparison with the TuMV samples. We also analysed Plum pox virus data available in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Short Read Archive (SRA) database (accession numbers ERX013141 and ERX013142; 12 libraries). The mean frequency of an “A” insertion at the GA6 site was 0.8%, with frequencies for individual samples ranging from 0.3 to 1.0% (Appendix Fig S3). Similarly, a low level (1–2%) of frameshift mutations at position 2,891 (which corresponds to the GA6 site) has been reported for Zucchini yellow mosaic virus 20. Together, these results indicate that around 0.8–2% of viral transcripts produced by the potyvirus polymerase allow expression of P3N-PIPO as a consequence of an “A” insertion at the GA6 site. Although previous mass spectrometric analysis of cDNAs derived from RNA from TuMV-infected plants failed to detect transcripts with insertions or deletions 4, this analysis may not have been sensitive enough to identify the low level of slippage observed. While we cannot rule out −1 PRF occurring at some level in TuMV or other potyvirid species, our data suggest that transcriptional slippage alone can account for P3N-PIPO expression. An earlier hypothesis that potyviruses might use a novel +2 PRF mechanism, involving re-pairing of the P- and A-site tRNAs from GAA and AAA to A_AA and A_AN, respectively 10, now seems unnecessary and unlikely. Homopolymeric runs of six or more adenosines or uridines are under-represented in potyvirus genomes If potyvirid polymerases are prone to slippage at GA6 sequences, selection might act against such sequences spontaneously arising at other locations (in any reading frame). In view of this, we re-ana-lysed all NCBI Potyviridae RefSeqs. Of 123 RefSeqs, only seven lack a GA6 sequence at the 5′ end of the pipo ORF (Appendix Dataset S1), while only twelve instances of GA6 sequences were found at other sites within the polyprotein ORFs (Appendix Table S2). Among potyvirid species, all three reading frames (GAA_AAA_A, G_AAA_AAA and

The antiviral restriction factor, tetherin, blocks the release of several different families of enveloped viruses, including the Coronaviridae. Tetherin is an interferon-induced protein that forms parallel homodimers between the host cell and viral particles, linking viruses to the surface of infected cells and inhibiting their release. We demonstrated that SARS-CoV-2 infection causes tetherin downregulation, and that tetherin depletion from cells enhances SARS-CoV-2 viral titres. We investigated the potential viral proteins involved in abrogating tetherin function and found that SARS-CoV-2 ORF3a reduces tetherin localisation within biosynthetic organelles via reduced retrograde recycling and increases tetherin localisation to late endocytic organelles. By removing tetherin from the Coronavirus budding compartments, ORF3a enhances virus release. We also found expression of Spike protein caused a reduction in cellular tetherin levels. Our results confirm that tetherin acts as a host restriction factor for SARS-CoV-2 and highlight the multiple distinct mechanisms by which SARS-CoV-2 subverts tetherin function.