The family Potyviridae includes >30% of known plant virus species, many of which are of great agricultural significance. These viruses have a positive sense RNA genome that is approximately 10 kb long and contains a single long ORF. The ORF is translated into a large polyprotein, which is cleaved into approximately 10 mature proteins. We report the discovery of a short ORF embedded within the P3 cistron of the polyprotein but translated in the +2 reading-frame. The ORF, termed pipo, is conserved and has a strong bioinformatic coding signature throughout the large and diverse Potyviridae family. Mutations that knock out expression of the PIPO protein in Turnip mosaic potyvirus but leave the polyprotein amino acid sequence unaltered are lethal to the virus. Immunoblotting with antisera raised against two nonoverlapping 14-aa antigens, derived from the PIPO amino acid sequence, reveals the expression of an approximately 25-kDa PIPO fusion product in planta. This is consistent with expression of PIPO as a P3-PIPO fusion product via ribosomal frameshifting or transcriptional slippage at a highly conserved G(1-2)A(6-7) motif at the 5' end of pipo. This discovery suggests that other short overlapping genes may remain hidden even in well studied virus genomes (as well as cellular organisms) and demonstrates the utility of the software package MLOGD as a tool for identifying such genes.

Influenza's Cryptic Constraint Because of the well-known pandemic potential of influenza viruses, it is important to understand the range of molecular interactions between the virus and its host. Despite years of intensive research on the virus, Jagger et al. (p. 199 , published online 28 June; see the Perspective by Yewdell and Ince ) have found that the influenza A virus has been hiding a gene in its small negative-sense RNA genome. An overlapping open reading frame was found contained in the PA viral RNA polymerase gene, which is accessed by ribosomal frameshifting to produce a fusion protein containing the N-terminal messenger RNA (mRNA) endonuclease domain of PA and an alternative C-terminal X domain. The resulting polypeptide, PA-X, selectively degrades host mRNAs and, in a mouse model of infection, modulated cellular immune responses, thus limiting viral pathogenesis.

The antiviral restriction factor, tetherin, blocks the release of several different families of enveloped viruses, including the Coronaviridae. Tetherin is an interferon-induced protein that forms parallel homodimers between the host cell and viral particles, linking viruses to the surface of infected cells and inhibiting their release. We demonstrated that SARS-CoV-2 infection causes tetherin downregulation, and that tetherin depletion from cells enhances SARS-CoV-2 viral titres. We investigated the potential viral proteins involved in abrogating tetherin function and found that SARS-CoV-2 ORF3a reduces tetherin localisation within biosynthetic organelles via reduced retrograde recycling and increases tetherin localisation to late endocytic organelles. By removing tetherin from the Coronavirus budding compartments, ORF3a enhances virus release. We also found expression of Spike protein caused a reduction in cellular tetherin levels. Our results confirm that tetherin acts as a host restriction factor for SARS-CoV-2 and highlight the multiple distinct mechanisms by which SARS-CoV-2 subverts tetherin function.

Abstract Background Throughout biology, multiple sequence alignments (MSAs) form the basis of much investigation into biological features and relationships. These alignments are at the heart of many bioinformatics analyses. However, sequences in MSAs are often incomplete or very divergent, which leads to poorly aligned regions or large gaps in alignments. This slows down computation and can impact conclusions without being biologically relevant. Therefore, cleaning the alignment by removing these regions can substantially improve analyses. Manual editing of MSAs is very widespread but is time-consuming and difficult to reproduce. Results We present a comprehensive, user-friendly MSA trimming tool with multiple visualisation options. Our highly customisable command line tool aims to give intervention power to the user by offering various options, and outputs graphical representations of the alignment before and after processing to give the user a clear overview of what has been removed. The main functionalities of the tool include removing regions of low coverage due to insertions, removing gaps, cropping poorly aligned sequence ends and removing sequences that are too divergent or too short. The thresholds for each function can be specified by the user and parameters can be adjusted to each individual MSA. CIAlign is designed with an emphasis on solving specific and common alignment problems and on providing transparency to the user. Conclusion CIAlign effectively removes problematic regions and sequences from MSAs and provides novel visualisation options. This tool can be used to refine alignments for further analysis and processing. The tool is aimed at anyone who wishes to automatically clean up parts of an MSA and those requiring a new, accessible way of visualising large MSAs.

ABSTRACT Identification of the full complement of genes in SARS-CoV-2 is a crucial step towards gaining a fuller understanding of its molecular biology. However, short and/or overlapping genes can be difficult to detect using conventional computational approaches, whereas high throughput experimental approaches – such as ribosome profiling – cannot distinguish translation of functional peptides from regulatory translation or translational noise. By studying regions showing enhanced conservation at synonymous sites in alignments of SARS-CoV and related viruses (subgenus Sarbecovirus ), and correlating with the conserved presence of an open reading frame and plausible translation mechanism, we identified a putative new gene, ORF3a*, overlapping ORF3a in an alternative reading frame. A recently published ribosome profiling study confirmed that ORF3a* is indeed translated during infection. ORF3a* is conserved across the subgenus Sarbecovirus , and encodes a 40–41 amino acid predicted transmembrane protein.

Abstract RNA viruses are abundant, highly diverse, and infect all or most eukaryotic organisms. However, only a tiny fraction of the number and diversity of RNA virus species have been catalogued. To cost effectively expand the diversity of known RNA virus sequences we mined publicly available transcriptomic datasets. We developed 77 family-level Hidden Markov Model profiles for the viral RNA dependent RNA polymerase – the only universal “hall-mark” gene of RNA viruses. By using these to search the NCBI Transcriptome Shotgun Assembly database, we identified 5,867 contigs encoding RNA virus RdRps or fragments thereof and analysed their diversity, taxonomic classification, phylogeny and host associations. Our study expands the known diversity of RNA viruses, and the 77 curated RdRp pHMMs provide a useful resource for the virus discovery community.

SUMMARY The SARS-CoV-2 genome encodes a multitude of accessory proteins. Using comparative genomic approaches, an additional accessory protein, ORF3c, has been predicted to be encoded within the ORF3a sgmRNA. Expression of ORF3c during infection has been confirmed independently by ribosome profiling. Despite ORF3c also being present in the 2002-2003 SARS-CoV, its function has remained unexplored. Here we show that ORF3c localises to mitochondria during infection, where it inhibits innate immunity by restricting IFN-β production, but not NF-κB activation or JAK-STAT signalling downstream of type I IFN stimulation. We find that ORF3c acts after stimulation with cytoplasmic RNA helicases RIG-I or MDA5 or adaptor protein MAVS, but not after TRIF, TBK1 or phospho-IRF3 stimulation. ORF3c co-immunoprecipitates with the antiviral proteins MAVS and PGAM5 and induces MAVS cleavage by caspase-3. Together, these data provide insight into an uncharacterised mechanism of innate immune evasion by this important human pathogen.

ABSTRACT Human astroviruses are small nonenveloped viruses with positive-sense single-stranded RNA genomes that contain three main open reading frames: ORF1a, ORF1b and ORF2. Astroviruses cause acute gastroenteritis in children worldwide and have been associated with encephalitis and meningitis in immunocompromised individuals. Through comparative genomic analysis of >400 astrovirus sequences, we identified a conserved “ORFX” overlapping the capsid-encoding ORF2 in genogroup I, III and IV astroviruses. ORFX appears to be subject to purifying selection, consistent with it encoding a functional protein product, termed XP. Using ribosome profiling of cells infected with human astrovirus 1, we confirm initiation at the ORFX AUG. XP-knockout astroviruses are strongly attenuated and after passaging can partly restore viral titer via pseudo-reversions, thus demonstrating that XP plays an important role in virus growth. To further investigate XP, we developed an astrovirus replicon system. We demonstrate that XP has only minor effects on RNA replication and structural protein production. Instead, XP associates with the plasma membrane with an extracellular N-terminus topology and promotes efficient virus release. Using two different assays, we show that expression of human or related astrovirus XPs leads to cell permeabilization, suggesting a viroporin-like activity. The discovery of XP advances our knowledge of these important human viruses and opens a new direction of research into astrovirus replication and pathogenesis.

Summary RNA structural elements occur in numerous single stranded (+)-sense RNA viruses. The stemloop 2 motif (s2m) is one such element with an unusually high degree of sequence conservation, being found in the 3’ UTR in the genomes of many astroviruses, some picornaviruses and noroviruses, and a variety of coronaviruses, including SARS-CoV and SARS-CoV-2. The evolutionary conservation and its occurrence in all viral subgenomic transcripts implicates a key role of s2m in the viral infection cycle. Our findings indicate that the element, while stably folded, can nonetheless be invaded and remodelled spontaneously by antisense oligonucleotides (ASOs) that initiate pairing in exposed loops and trigger efficient sequence-specific RNA cleavage in reporter assays. ASOs also act to inhibit replication in an astrovirus replicon model system in a sequence-specific, dose-dependent manner and inhibit SARS-CoV-2 infection in cell culture. Our results thus permit us to suggest that the s2m element is a site of vulnerability readily targeted by ASOs, which show promise as anti-viral agents.

Ilarviruses are a relatively understudied but important group of plant RNA viruses that includes a number of crop pathogens. Their genomes comprise three RNA segments encoding two replicase subunits, movement protein, coat protein (CP), and (in some ilarvirus subgroups) a protein that suppresses RNA silencing. Here we report that, in many ilarviruses, RNA3 encodes an additional protein (termed CP-RT) as a result of ribosomal readthrough of the CP stop codon into a short downstream readthrough (RT) ORF. Using asparagus virus 2 as a model, we find that CP-RT is expressed in planta where it functions as a weak suppressor of RNA silencing. CP-RT expression is essential for persistent systemic infection in leaves and shoot apical meristem. CP-RT function is dependent on a putative zinc-finger motif within RT. Replacing the asparagus virus 2 RT with the RT of an ilarvirus from a different subgroup restored the ability to establish persistent infection. These findings open up a new avenue for research on ilarvirus silencing suppression, persistent meristem invasion and vertical transmission.