The failure of axons to regenerate is a major obstacle for functional recovery after central nervous system (CNS) injury. Removing extracellular inhibitory molecules results in limited axon regeneration in vivo. To test for the role of intrinsic impediments to axon regrowth, we analyzed cell growth control genes using a virus-assisted in vivo conditional knockout approach. Deletion of PTEN (phosphatase and tensin homolog), a negative regulator of the mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway, in adult retinal ganglion cells (RGCs) promotes robust axon regeneration after optic nerve injury. In wild-type adult mice, the mTOR activity was suppressed and new protein synthesis was impaired in axotomized RGCs, which may contribute to the regeneration failure. Reactivating this pathway by conditional knockout of tuberous sclerosis complex 1, another negative regulator of the mTOR pathway, also leads to axon regeneration. Thus, our results suggest the manipulation of intrinsic growth control pathways as a therapeutic approach to promote axon regeneration after CNS injury.

BackgroundTuberous sclerosis complex is highly variable in clinical presentation and findings. Disease manifestations continue to develop over the lifetime of an affected individual. Accurate diagnosis is fundamental to implementation of appropriate medical surveillance and treatment. Although significant advances have been made in the past 15 years in the understanding and treatment of tuberous sclerosis complex, current clinical diagnostic criteria have not been critically evaluated or updated since the last clinical consensus conference in 1998.MethodsThe 2012 International Tuberous Sclerosis Complex Consensus Group, comprising 79 specialists from 14 countries, was organized into 12 subcommittees, each led by a clinician with advanced expertise in tuberous sclerosis complex and the relevant medical subspecialty. Each subcommittee focused on a specific disease area with important diagnostic implications and was charged with reviewing prevalence and specificity of disease-associated clinical findings and their impact on suspecting and confirming the diagnosis of tuberous sclerosis complex.ResultsClinical features of tuberous sclerosis complex continue to be a principal means of diagnosis. Key changes compared with 1998 criteria are the new inclusion of genetic testing results and reducing diagnostic classes from three (possible, probable, and definite) to two (possible, definite). Additional minor changes to specific criterion were made for additional clarification and simplification.ConclusionsThe 2012 International Tuberous Sclerosis Complex Diagnostic Criteria provide current, updated means using best available evidence to establish diagnosis of tuberous sclerosis complex in affected individuals.

Both heterozygous loss and homozygous loss of Tsc1 in mouse cerebellar Purkinje cells (PCs) result in autistic-like behaviours, which can be prevented by treatment with the mTOR inhibitor, rapamycin; these findings demonstrate critical roles for PCs in autistic-like behaviours in mice. Tuberous sclerosis is a rare tumour-causing genetic disorder that results from mutation of the genes TSC1 or TSC2. Affected individuals often also have autism spectrum disorder associated with cerebellar pathology. Because clinical studies have implicated cerebellar dysfunction in the pathogenesis of autism, Mustafa Sahin and colleagues studied the functional consequences of disrupting the cerebellar Tsc1 gene in mice. The mutant mice exhibit pathological features common in patients with autism —reduced Purkinje cell numbers and increased markers of neuronal stress — and mice lacking Tsc1 in cerebellar Purkinje cells display autism-related behaviours. Both the cerebellar pathology and behavioural features are ameliorated by treating the mice with the mTOR inhibitor rapamycin. Autism spectrum disorders (ASDs) are highly prevalent neurodevelopmental disorders1, but the underlying pathogenesis remains poorly understood. Recent studies have implicated the cerebellum in these disorders, with post-mortem studies in ASD patients showing cerebellar Purkinje cell (PC) loss2,3, and isolated cerebellar injury has been associated with a higher incidence of ASDs4. However, the extent of cerebellar contribution to the pathogenesis of ASDs remains unclear. Tuberous sclerosis complex (TSC) is a genetic disorder with high rates of comorbid ASDs5 that result from mutation of either TSC1 or TSC2, whose protein products dimerize and negatively regulate mammalian target of rapamycin (mTOR) signalling. TSC is an intriguing model to investigate the cerebellar contribution to the underlying pathogenesis of ASDs, as recent studies in TSC patients demonstrate cerebellar pathology6 and correlate cerebellar pathology with increased ASD symptomatology7,8. Functional imaging also shows that TSC patients with ASDs display hypermetabolism in deep cerebellar structures, compared to TSC patients without ASDs9. However, the roles of Tsc1 and the sequelae of Tsc1 dysfunction in the cerebellum have not been investigated so far. Here we show that both heterozygous and homozygous loss of Tsc1 in mouse cerebellar PCs results in autistic-like behaviours, including abnormal social interaction, repetitive behaviour and vocalizations, in addition to decreased PC excitability. Treatment of mutant mice with the mTOR inhibitor, rapamycin, prevented the pathological and behavioural deficits. These findings demonstrate new roles for Tsc1 in PC function and define a molecular basis for a cerebellar contribution to cognitive disorders such as autism.

Tuberous sclerosis complex is a genetic disorder affecting every organ system, but disease manifestations vary significantly among affected individuals. The diverse and varied presentations and progression can be life-threatening with significant impact on cost and quality of life. Current surveillance and management practices are highly variable among region and country, reflective of the fact that last consensus recommendations occurred in 1998 and an updated, comprehensive standard is lacking that incorporates the latest scientific evidence and current best clinical practices.The 2012 International Tuberous Sclerosis Complex Consensus Group, comprising 79 specialists from 14 countries, was organized into 12 separate subcommittees, each led by a clinician with advanced expertise in tuberous sclerosis complex and the relevant medical subspecialty. Each subcommittee focused on a specific disease area with important clinical management implications and was charged with formulating key clinical questions to address within its focus area, reviewing relevant literature, evaluating the strength of data, and providing a recommendation accordingly.The updated consensus recommendations for clinical surveillance and management in tuberous sclerosis complex are summarized here. The recommendations are relevant to the entire lifespan of the patient, from infancy to adulthood, including both individuals where the diagnosis is newly made as well as individuals where the diagnosis already is established.The 2012 International Tuberous Sclerosis Complex Consensus Recommendations provide an evidence-based, standardized approach for optimal clinical care provided for individuals with tuberous sclerosis complex.

Ataxia-telangiectasia mutated (ATM) is a cellular damage sensor that coordinates the cell cycle with damage-response checkpoints and DNA repair to preserve genomic integrity. However, ATM also has been implicated in metabolic regulation, and ATM deficiency is associated with elevated reactive oxygen species (ROS). ROS has a central role in many physiological and pathophysiological processes including inflammation and chronic diseases such as atherosclerosis and cancer, underscoring the importance of cellular pathways involved in redox homeostasis. We have identified a cytoplasmic function for ATM that participates in the cellular damage response to ROS. We show that in response to elevated ROS, ATM activates the TSC2 tumor suppressor via the LKB1/AMPK metabolic pathway in the cytoplasm to repress mTORC1 and induce autophagy. Importantly, elevated ROS and dysregulation of mTORC1 in ATM-deficient cells is inhibited by rapamycin, which also rescues lymphomagenesis in Atm -deficient mice. Our results identify a cytoplasmic pathway for ROS-induced ATM activation of TSC2 to regulate mTORC1 signaling and autophagy, identifying an integration node for the cellular damage response with key pathways involved in metabolism, protein synthesis, and cell survival.

Eph receptors transduce short-range repulsive signals for axon guidance by modulating actin dynamics within growth cones. We report the cloning and characterization of ephexin, a novel Eph receptor-interacting protein that is a member of the Dbl family of guanine nucleotide exchange factors (GEFs) for Rho GTPases. Ephrin-A stimulation of EphA receptors modulates the activity of ephexin leading to RhoA activation, Cdc42 and Rac1 inhibition, and cell morphology changes. In addition, expression of a mutant form of ephexin in primary neurons interferes with ephrin-A-induced growth cone collapse. The association of ephexin with Eph receptors constitutes a molecular link between Eph receptors and the actin cytoskeleton and provides a novel mechanism for achieving highly localized regulation of growth cone motility.

Tuberous sclerosis (TSC) is a hamartoma syndrome attributable to mutations in either TSC1 or TSC2 in which brain involvement causes epilepsy, mental retardation, and autism. We have reported recently (Meikle et al., 2007) a mouse neuronal model of TSC in which Tsc1 is ablated in most neurons during cortical development. We have tested rapamycin and RAD001 [40- O -(2-hydroxyethyl)-rapamycin], both mammalian target of rapamycin mTORC1 inhibitors, as potential therapeutic agents in this model. Median survival is improved from 33 d to more than 100 d; behavior, phenotype, and weight gain are all also markedly improved. There is brain penetration of both drugs, with accumulation over time with repetitive treatment, and effective reduction of levels of phospho-S6, a downstream target of mTORC1. In addition, there is restoration of phospho-Akt and phospho-glycogen synthase kinase 3 levels in the treated mice, consistent with restoration of Akt function. Neurofilament abnormalities, myelination, and cell enlargement are all improved by the treatment. However, dysplastic neuronal features persist, and there are only modest changes in dendritic spine density and length. Strikingly, mice treated with rapamycin or RAD001 for 23 d only (postnatal days 7–30) displayed a persistent improvement in phenotype, with median survival of 78 d. In summary, rapamycin/RAD001 are highly effective therapies for this neuronal model of TSC, with benefit apparently attributable to effects on mTORC1 and Akt signaling and, consequently, cell size and myelination. Although caution is appropriate, the results suggest the possibility that rapamycin/RAD001 may have benefit in the treatment of TSC brain disease, including infantile spasms.

While prime editing enables precise sequence changes in DNA, cellular determinants of prime editing remain poorly understood. Using pooled CRISPRi screens, we discovered that DNA mismatch repair (MMR) impedes prime editing and promotes undesired indel byproducts. We developed PE4 and PE5 prime editing systems in which transient expression of an engineered MMR-inhibiting protein enhances the efficiency of substitution, small insertion, and small deletion prime edits by an average 7.7-fold and 2.0-fold compared to PE2 and PE3 systems, respectively, while improving edit/indel ratios by 3.4-fold in MMR-proficient cell types. Strategic installation of silent mutations near the intended edit can enhance prime editing outcomes by evading MMR. Prime editor protein optimization resulted in a PEmax architecture that enhances editing efficacy by 2.8-fold on average in HeLa cells. These findings enrich our understanding of prime editing and establish prime editing systems that show substantial improvement across 191 edits in seven mammalian cell types.

Tuberous sclerosis (TSC) is a hamartoma syndrome caused by mutations in TSC1 or TSC2 in which cerebral cortical tubers and seizures are major clinical issues. We have engineered mice in which most cortical neurons lose Tsc1 expression during embryonic development. These Tsc1 mutant mice display several neurological abnormalities beginning at postnatal day 5 with subsequent failure to thrive and median survival of 35 d. The mice also display clinical and electrographic seizures both spontaneously and with physical stimulation, and some seizures end in a fatal tonic phase. Many cortical and hippocampal neurons are enlarged and/or dysplastic in the Tsc1 mutant mice, strongly express phospho-S6, and are ectopic in multiple sites in the cortex and hippocampus. There is a striking delay in myelination in the mutant mice, which appears to be caused by an inductive neuronal defect. This new TSC brain model replicates several features of human TSC brain lesions and implicates an important function of Tsc1/Tsc2 in neuronal development.

Mammalian target of rapamycin, mTOR, is a major sensor of nutrient and energy availability in the cell and regulates a variety of cellular processes, including growth, proliferation, and metabolism. Loss of the tuberous sclerosis complex genes (TSC1 or TSC2) leads to constitutive activation of mTOR and downstream signaling elements, resulting in the development of tumors, neurological disorders, and at the cellular level, severe insulin/IGF-1 resistance. Here, we show that loss of TSC1 or TSC2 in cell lines and mouse or human tumors causes endoplasmic reticulum (ER) stress and activates the unfolded protein response (UPR). The resulting ER stress plays a significant role in the mTOR-mediated negative-feedback inhibition of insulin action and increases the vulnerability to apoptosis. These results demonstrate ER stress as a critical component of the pathologies associated with dysregulated mTOR activity and offer the possibility to exploit this mechanism for new therapeutic opportunities.