The spectrin superfamily of proteins plays key roles in assembling the actin cytoskeleton in various cell types, crosslinks actin filaments, and acts as scaffolds for the assembly of large protein complexes involved in structural integrity and mechanosensation, as well as cell signaling. α-actinins in particular are the major actin crosslinkers in muscle Z-disks, focal adhesions, and actin stress fibers. We report a complete high-resolution structure of the 200 kDa α-actinin-2 dimer from striated muscle and explore its functional implications on the biochemical and cellular level. The structure provides insight into the phosphoinositide-based mechanism controlling its interaction with sarcomeric proteins such as titin, lays a foundation for studying the impact of pathogenic mutations at molecular resolution, and is likely to be broadly relevant for the regulation of spectrin-like proteins.

Abstract Background and aims TLR4 is an important innate immune receptor that recognizes bacterial LPS, viral proteins and other pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It is expressed on tissue-resident and immune cells. We previously proposed a model whereby SARS-CoV-2 activation of TLR4 via its spike glycoprotein S1 domain increases ACE2 expression, viral loads and hyperinflammation with COVID-19 disease [1]. Here we test this hypothesis in vitro and demonstrate that the SARS-CoV-2 spike S1 domain is a TLR4 agonist in rat and human cells and induces a pro-inflammatory M1 macrophage phenotype in human THP-1 monocyte-derived macrophages. Methods Adult rat cardiac tissue resident macrophage-derived fibrocytes (rcTMFs) were treated with either bacterial LPS or recombinant SARS-CoV-2 spike S1 glycoprotein. The expression of ACE2 and other inflammatory and fibrosis markers were assessed by immunoblotting. S1/TLR4 co-localisation/binding was assessed by immunocytochemistry and proximity ligation assays on rcTMFs and human HEK-293 HA-TLR4-expressing cells. THP-1 monocytes were differentiated into M1 or M2 macrophages with LPS/IFNγ, S1/IFNγ or IL-4 and RNA was extracted for RT-qPCR of M1/M2 markers and ACE2. Results TLR4 activation by spike S1 or LPS resulted in the upregulation of ACE2 in rcTMFs as shown by immunoblotting. Likewise, spike S1 caused TLR4-mediated induction of the inflammatory/wound healing marker COX-2 and concomitant downregulation of the fibrosis markers CTGF and Col3a1, similar to LPS. The specific TLR4 TIR domain signalling inhibitor CLI-095 (Resatorvid®), blocked the effects of spike S1 and LPS, confirming that spike S1 is a TLR4 agonist and viral PAMP (VAMP). ACE2 expression was also inhibited by the dynamin inhibitor Dynasore®, suggesting ACE2 expression is mediated by the alternative endosomal/β-interferon pathway. Confocal immunofluorescence microscopy confirmed 1:1 stoichiometric spike S1 co-localisation with TLR4 in rat and human cells. Furthermore, proximity ligation assays confirmed spike S1 and TLR4 binding in human and rat cells. Spike S1/IFN-γ treatment of THP-1-derived macrophages induced pro-inflammatory M 1 polarisation as shown by an increase in IL-1β and IL-6 mRNA. Conclusions These results confirm that TLR4 is activated by the SARS-CoV-2 spike protein S1 domain and therefore TLR4 may be a receptor/accessory factor for the virus. By binding to and activating TLR4, spike S1 caused upregulation of ACE2, which may facilitate viral entry into cells. In addition, pro-inflammatory M 1 macrophage polarisation via TLR4 activation, links TLR4 activation by spike S1 to inflammation. The clinical trial testing of CLI-095 (Resatorvid®) and other TLR4 antagonists in severe COVID-19, to reduce both viral entry into cells and hyperinflammation, is warranted. Our findings likely represent an important development in COVID-19 pathophysiology and treatment, particularly regarding cardiac complications and the role of macrophages.

The extracellular matrix (ECM) supports blood vessel architecture and functionality and undergoes active remodelling during vascular repair and atherogenesis. Vascular smooth muscle cells (VSMCs) are essential for vessel repair and, via their secretome, are able to invade from the vessel media into the intima to mediate ECM remodelling. Accumulation of fibronectin (FN) is a hallmark of early vascular repair and atherosclerosis and here we show that FN stimulates VSMCs to secrete small extracellular vesicles (sEVs) by activating the β1 integrin/FAK/Src pathway as well as Arp2/3-dependent branching of the actin cytoskeleton. Spatially, sEV were secreted via filopodia-like cellular protrusions at the leading edge of migrating cells. We found that sEVs are trapped by the ECM in vitro and colocalise with FN in symptomatic atherosclerotic plaques in vivo. Functionally, ECM-trapped sEVs induced the formation of focal adhesions (FA) with enhanced pulling forces at the cellular periphery. Proteomic and GO pathway analysis revealed that VSMC-derived sEVs display a cell adhesion signature and are specifically enriched with collagen VI. In vitro assays identified collagen VI as playing the key role in cell adhesion and invasion. Taken together our data suggests that the accumulation of FN is a key early event in vessel repair acting to promote secretion of collage VI enriched sEVs by VSMCs. These sEVs stimulate migration and invasion by triggering peripheral focal adhesion formation and actomyosin contraction to exert sufficient traction forces to enable VSMC movement within the complex vascular ECM network.

Nemaline myopathy (NM) is a genetically heterogeneous skeletal muscle disorder caused by mutations predominately affecting contractile filaments, in particular thin filament structure and/or regulation. The underlying cellular pathophysiology of this disease remains largely unclear. Here, we report novel pathological defects in skeletal muscle fibres of mice and patients with NM, including disrupted nuclear envelope, altered chromatin arrangement, and disorganisation of the cortical cytoskeleton. We demonstrate that such nuclear defects are caused by impairment of muscle fibre contractility, and that cytoskeletal organisation determines nuclear morphology. Our results overlap with findings in diseases caused by mutations in nuclear envelope or cytoskeletal proteins. Given the important role of nuclear shape and envelope in regulating gene expression, and the cytoskeleton in maintaining muscle fibre integrity, our findings are likely to underlie some of the hallmarks of NM, which include broad transcriptional alterations, arrested muscle fibre growth, contractile filament disarray and altered mechanical properties.

Abstract Background Truncating variants ( TTN tv) in the TTN gene, encoding the giant sarcomeric protein titin, cause a range of human cardiac and skeletal muscle disorders of varying penetrance and severity. The effects of variant location on clinical manifestations are incompletely understood. Methods We generated six zebrafish lines carrying tv in the ttn.2 gene at the Z-disk, I-band, A-band, and M-band titin regions. Expression of titin transcripts was evaluated using qPCR. Phenotype analysis was performed during embryonic development and in adult hearts. Results Using location-specific primers, we found a significant reduction of Z-disk and I-band ttn.2 transcripts in all homozygous embryos but levels of A-band and M-band transcripts were reduced only in lines with truncations distal to the cronos promoter. Homozygous embryos uniformly died by 7-10 days post fertilization with marked impairment of cardiac morphology and function. Skeletal muscle motility and sarcomere organization were more disrupted in mutants with truncations distal to the cronos promoter compared to those proximal. The most C-terminal line (e232), which lacked only the titin kinase and M-band regions, differed from other lines, with homozygous embryos showing incorporation of truncated Ttn.2/Cronos protein and normal sarcomere assembly, but selective degradation of fast skeletal muscle sarcomeres. Heterozygous embryos were phenotypically indistinguishable from wild-type. High-frequency echocardiography in adult heterozygous fish showed reduced ventricular contraction under resting conditions in A-band mutants. Heterozygous Z-disk and I-band mutants had no significant baseline impairment but were unable to augment ventricular contraction in response to acute adrenaline exposure, indicating a lack of cardiac reserve. Conclusions Our data suggest that cardiac and skeletal muscle dysfunction associated with truncating ttn.2 variants is influenced by age, variant location, and the amount of functional titin protein. The distinctive phenotype associated with distal C-terminal truncations may reflect different requirement for C-terminal titin for maintenance of fast, slow and cardiac muscle sarcomeres.