ABSTRACT mRNA vaccines have emerged as a most promising and potent platform in the fight against various diseases including the COVID-19 pandemic. However, the intrinsic instability, varying side effects associated with the delivery systems, and continuous emergence of virus variants highlight the urgent need for the development of stable, safe and efficacious mRNA vaccines. In this study, by screening a panel of proprietary biodegradable ionizable lipidoids, we reported on a novel mRNA vaccine (cmRNA-1130) formed from a biodegradable lipidoid with eight ester bonds in the branched tail (AX4) and synthetic circular mRNA (cmRNA) encoding the trimeric Delta receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 spike protein for the induction of robust immune activation. The AX4-based lipid nanoparticles (AX4-LNP) revealed much faster elimination rate from liver and spleen in comparison with commercialized MC3-based LNP (MC3-LNP) and afforded normal level of alanine transferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and creatinine (CRE) in BALB/c mice. Following intramuscular (IM) administration in BALB/c mice, cmRNA-1130 elicited potent and sustained neutralizing antibodies, RBD-specific CD4 + and CD8 + T effector memory cells (Tem), and Th1-biased T cell activations. cmRNA-1130 vaccine showed excellent stability against 6-month storage at 4 □ and freezing-thawing cycles. In brief, our study highlights mRNA vaccines based on cmRNA and biodegradable AX4 lipids hold great potential as superb therapeutic platforms for the treatment of varying diseases.

Abstract Translatable circular RNAs (circRNAs) are emerging as a crucial molecular format for transient protein expression, with high potential to be an alternative for linear mRNA to reshape the landscape of mRNA pharmaceutical industry. Canonical Anabaena permuted intron-exon ( Ana PIE) format that developed by ORNA is an efficient method for RNA circularization, and the engineered circRNAs direct supreme protein expression in eukaryotic cells. However, recent studies revealed that this method may unavoidably result in a remain of immunogenicity in the circRNA products, albeit after thorough RNA purification. In the current study, we develop a novel strategy for efficient generation of circRNA, via the permuted T4Td introns mediated autocatalytically ribozymatic reaction mediated ligation of the flanking segment sequences that concealing in ORF or translation initiation sequence (normally equal to IRES). This strategy universally realizes around 90% circularization effectivity, and the circRNA products can be purified to around 90% purity by our new purification method, and presented thoroughly minimized immunogenicity, thus is termed “Clean-PIE”. The purified circRNAs are found to direct potent and durable expression of various proteins in vitro and in vivo. The partly purified Fluc circRNA by HPLC-SEC was found to direct Fluc expression in muscle for no less than 20 days. The highly purified circRNA exhibits much stronger protein expression in vitro and in vivo, and presumed a longer duration. Additionally, the scale-up of RNA circularization with the RNA precursors from 1 L transcription revealed high circularization effectivity (around 90%) and a high productivity of the final circRNA products. Collectively, Clean-PIE is a novel circRNA platform that possesses high circularization effectivity, enabled high RNA purity and thoroughly minimized immunogenicity, as well as scaling-up accessibility and directing extreme durability of protein expression, thus has the potential to develop advanced RNA vaccines and therapeutics in pharmaceutical industrial scale.

Abstract Although proteolysis targeting chimera (PROTAC) technology that hijacking the ubiquitin-proteasome system (UPS) to artificially degrade protein is an emerging promising technology for many undruggable targets, it still faces several challenges, such as the difficulty to select high specificity molecule to protein of interest (POI), and only few of the E3-ligase are suitable for PROTAC mediated protein degradation. Protein-based PROTAC, termed BioPROTAC, owns the advantage of specificity but lacks membrane permeability. Here, we develop a new targeted protein degrading platform, which we termed RiboPROTAC, by encoding BioPROTAC protein degraders with circular mRNA (cmRNA) and delivering intracellularly. In this way, intracellular protein GFP and nuclear protein PCNA were successfully degraded. For PCNA targeting, not only the level of target protein is strongly decreased, but also the cell function related is strongly interfered, such as cell proliferation, apoptosis, as well as the cell cycle. What is more, for the first time, we observed that degrading PCNA with RiboPROTAC causes immunogenic cell death (ICD), although not strong, but was verified in vivo. Importantly, our in vivo results demonstrated that cmRNA encoded PCNA degrader exhibited significant tumor suppression effect, thus we provide the first proof of concept for the application of RiboPROTAC as potential mRNA therapeutic. We consider that RiboPROTAC is a new and superior PROTAC technology for targeting the undruggable targets.

Abstract The application of mRNA as a novel kind of vaccine has been proved recently, due to the emergence use authorization (EUA) by FDA for the two COVID-19 mRNA vaccines developed by Moderna and BioNTech. Both of the two vaccines are based on canonical linear mRNA, and encapsulated by lipid nanoparticle (LNP). Circular mRNA, which is found to mediate potent and durable protein expression, is an emerging technology recently. Owing to its simplicity of manufacturing and superior performance of protein expression, circular mRNA is believed to be a disruptor for mRNA area. However, the application of circular mRNA is still at an initiation stage, proof of concept for its usage as future medicine or vaccine is necessary. In the current study, we established a novel kind of circular mRNA, termed C-RNA, based on Echovirus 29 (E29)-derived internal ribosome entry sites (IRES) and newly designed homology arms and RNA spacers. Our results demonstrated that this kind of circular mRNA is able to mediate strong and durable protein expression, compared to typical linear mRNA. Moreover, for the first time, our study demonstrated that direct intratumoral administration of C-RNA encoding a mixture of cytokines achieved successful modulation of intratumoral and systematic anti-tumor immune responses and finally leading to an enhancement of anti-PD-1 antibody-induced tumor repression in syngeneic mouse model. Additionally, after an optimization of the circular mRNA formulation, a significant improvement of C-RNA mediated protein expression was observed. With this optimized formulation, C-RNA induced enhanced anti-tumor effect via intratumoral administration and elicited significant activation of tumor-infiltrated total T cells and CD8 + T cells. Collectively, we established C-RNA, a novel circular mRNA platform, and demonstrated that it can be applied for direct intratumoral administration for cancer therapy.

TG6A-LNP loading with FGF18 circular mRNA-engineered mesenchymal stem cells for healing of osteoarthritis.

Abstract Anaplasma phagocytophilum , the aetiologic agent of human granulocytic anaplasmosis (HGA) is an obligate intracellular Gram-negative bacterium. During infection, A. phagocytophilum enhances the adhesion of neutrophils to infected endothelial cells. However the bacterial factors contributing to this phenomenon remain unknown. In this study, we characterized a type IV secretion system substrate of A. phagocytophilum , AFAP (an a ctin f ilament-associated A naplasma phagocytophilum p rotein), and found it enhanced cell adhesion. Tandem affinity purification combined with mass spectrometry identified host nucleolin as an AFAP-binding protein. Further study showed disruption of nucleolin by RNA interference and treatment of a nucleolin-binding DNA aptamer AS1411 attenuated AFAP-mediated cell adhesion. The characterization of AFAP with enhancement effect on cell adhesion and identification of its interaction partner may help understand the mechanism underlying A. phagocytophilum -promoting cell adhesion, facilitating elucidation of HGA pathogenesis. Highlights Anaplasma phagocytophilum AFAP localized to cell periphery. AFAP enhanced cell adhesion. AFAP interacted with host nucleolin. Disruption of nucleolin attenuated AFAP-mediated cell adhesion.

As an advanced nucleic acid therapeutical modality, mRNA can express any type of protein in principle and thus holds great potential to prevent and treat various diseases. Despite the success in COVID-19 mRNA vaccines, direct local delivery of mRNA into the lung by inhalation would greatly reinforce the treatment of pulmonary pathogens and diseases. Herein, we developed lipid nanoparticles (LNPs) from degradable ionizable glycerolipids for potent pulmonary mRNA delivery via nebulization. A panel of proprietary ionizable glycerolipids with branched tails and five ester bonds were developed through a three-step esterification reaction, and LNPs formed from a lead glycerolipid identified as TG4C enabled highly efficient in vivo mRNA delivery via systemic administration with around 6-fold higher luciferase protein expression than commercial LNPs from SM102 and Dlin-MC3-DMA (MC3). Formulation screening revealed that LNPs formed at a TG4C:DOPE:cholesterol:DMG-PEG molar ratio of 50:10:38.5:1.5 (TG4C-LNPs4) had high stability against nebulization with slight changes of size distribution and mRNA encapsulation efficiency, and the nebulized TG4C-LNPs4 afforded an equivalent percentage of positive cells and a slightly lower EGFP fluorescence intensity in lung cell lines (A549, BEAS-2B). Following pulmonary delivery in mice, TG4C-LNPs4 induced efficient transfection in the majority of epithelial cells in the lung, leading to apparent bioluminescence evenly distributed in all five lung lobes. In an elastase-induced emphysema model in mice, TG4C-LNPs4 loaded with mRNA encoding hepatocyte growth factor could significantly suppress the secretion of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, and TNF-α) in bronchoalveolar lavage fluid and counteract the alveoli wall thinning. Notably, partial substitution (25%) of cholesterol with budesonide, an anti-inflammatory glucocorticoid, in TG4C-LNPs4 generated equivalent protein expression and significantly improved therapeutic efficacy. Taken together, our study provides robust and high-performing nanovehicles based on degradable ionizable glycerolipids, enabling potently local mRNA delivery to the lung for the treatment of pulmonary diseases.