Electron microscopy (EM) achieves the highest spatial resolution in protein localization, but specific protein EM labeling has lacked generally applicable genetically encoded tags for in situ visualization in cells and tissues. Here we introduce "miniSOG" (for mini Singlet Oxygen Generator), a fluorescent flavoprotein engineered from Arabidopsis phototropin 2. MiniSOG contains 106 amino acids, less than half the size of Green Fluorescent Protein. Illumination of miniSOG generates sufficient singlet oxygen to locally catalyze the polymerization of diaminobenzidine into an osmiophilic reaction product resolvable by EM. MiniSOG fusions to many well-characterized proteins localize correctly in mammalian cells, intact nematodes, and rodents, enabling correlated fluorescence and EM from large volumes of tissue after strong aldehyde fixation, without the need for exogenous ligands, probes, or destructive permeabilizing detergents. MiniSOG permits high quality ultrastructural preservation and 3-dimensional protein localization via electron tomography or serial section block face scanning electron microscopy. EM shows that miniSOG-tagged SynCAM1 is presynaptic in cultured cortical neurons, whereas miniSOG-tagged SynCAM2 is postsynaptic in culture and in intact mice. Thus SynCAM1 and SynCAM2 could be heterophilic partners. MiniSOG may do for EM what Green Fluorescent Protein did for fluorescence microscopy.

Infrared Vision Proteins from jellyfish and corals that fluoresce in the visible wavelength range have revolutionized optical imaging of cells. However, these wavelengths are absorbed by hemoglobin, water, and lipids and the proteins are thus not appropriate for deep-tissue imaging. Now Shu et al. (p. 804 ) have engineered a bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans that incorporates biliverdin as the chromophore, to fluoresce with excitation and emission spectra of 648 and 708 nanometers, respectively. These infrared fluorescent proteins are expressed well in mammalian cells and mice, and can be used for whole-body imaging.

mFruits are second-generation monomeric red fluorescent proteins (mRFPs) that have improved brightness and photostability compared to the first-generation mRFP1. The emission and excitation maxima are distributed over the remarkably large ranges of about 550-650 and 540-590 nm, respectively; however, the variations in the spectra can be traced to a few key amino acids. Spectroscopic and atomic resolution crystallographic analyses of three representatives, mOrange, mStrawberry, and mCherry, reveal that different mechanisms operate to establish the excitation and emission maxima. Evidently, they all undergo the second oxidation step to produce an acylimine linkage in the polypeptide backbone. In comparison to the progenitor DsRed, direct covalent modification to this linkage (mOrange) and indirect modification of the chromophore environment (mStrawberry and mCherry) produce strong blue- and red-shifted variants. The blue shift of mOrange is induced by an unprecedented covalent modification of the protein backbone. The electron-density map indicates the formation of a third heterocycle, 2-hydroxy-dihydrooxazole, upon the reaction of Thr 66 Ogamma with the polypeptide backbone, which in turn reduces the conjugation of the carbonyl at position 65 with the rest of the chromophore. In mStrawberry and mCherry, the movement of charged Lys 70 and protonation of Glu 215 are proposed to modify the chromophore electron-density distribution, inducing the red shift. pH-dependent spectral shifts of mCherry and mStrawberry appear to result from the titration of Glu 215, although, for mStrawberry, partial cyclization of Thr 66 may contribute at high pH.

Abstract Dysregulation and enhanced expression of MYC transcription factors (TFs) including MYC and MYCN contribute to the majority of human cancers. For example, MYCN is amplified up to several hundred-fold in high-risk neuroblastoma. The resulting overexpression of N-myc aberrantly activates genes that are not activated at low N-myc levels and drives proliferation and cell survival. Whether increasing N-myc levels simply mediate binding to lower-affinity binding sites in the genome or fundamentally changes the activation process remains unclear. One such activation mechanism that could become important above threshold levels of N-myc is the formation of aberrant transcriptional condensates through phase separation. Phase separation has recently been linked to transcriptional regulation, but how strongly it contributes to gene activation remains unclear. Here we characterized the phase behavior of N-myc and showed that it can form dynamic condensates that bear the hallmarks of transcriptional activity. We tested the contribution of phase separation to N-myc-mediated gene expression by using a chemogenetic tool that allowed us to compare non-phase-separated and phase-separated conditions at identical N-myc levels, which both showed a strong impact on gene expression compared to no N-myc expression. However, we found that only a small fraction of <3% of N-myc-regulated genes is further affected by phase separation, but that these events include the activation of key oncogenes and the repression of tumor suppressors. Indeed, phase separation increases cell survival by ∼15% corroborating the biological effects of the transcriptional changes. However, our results also show that >97% of N-myc-regulated genes are not affected by N-myc phase separation, highlighting that transcription can be activated effectively by diffuse complexes of TFs with the transcriptional machinery.

SARS-CoV-2 is the coronavirus that causes the respiratory disease COVID-19, which is now the third-leading cause of death in the United States. The FDA has recently approved remdesivir, an inhibitor of SARS-CoV-2 replication, to treat COVID-19, though recent data from the WHO shows little to no benefit with use of this anti-viral agent. Here we report the discovery of ethacridine, a safe antiseptic use in humans, as a potent drug for use against SARS-CoV-2 (EC50 ~ 0.08 μM). Ethacridine was identified via high-throughput screening of an FDA-approved drug library in living cells using a fluorescent assay. Interestingly, the main mode of action of ethacridine is through inactivation of viral particles, preventing their binding to the host cells. Indeed, ethacridine is effective in various cell types, including primary human nasal epithelial cells. Taken together, these data identify a promising, potent, and new use of the old drug possessing a distinct mode of action for inhibiting SARS-CoV-2.

Transcription factor dynamics are used to selectively engage gene regulatory programs. Biomolecular condensates have emerged as an attractive signaling substrate in this process, but the underlying mechanisms are not well-understood. Here, we probed the molecular basis of YAP signal integration through transcriptional condensates. Leveraging light-sheet single-molecule imaging and synthetic condensates, we demonstrate charge-mediated co-condensation of the transcriptional regulators YAP and Mediator into transcriptionally active condensates in stem cells. IDR sequence analysis and YAP protein engineering demonstrate that instead of the net charge, YAP signaling specificity is established through its negative charge patterning that interacts with Mediator's positive charge blocks. The mutual enhancement of YAP/Mediator co-condensation is counteracted by negative feedback from transcription, driving an adaptive transcriptional response that is well-suited for decoding dynamic inputs. Our work reveals a molecular framework for YAP condensate formation and sheds new light on the function of YAP condensates for emergent gene regulatory behavior.

Current efforts in the proteolysis targeting chimera (PROTAC) field mostly focus on choosing the appropriate E3 ligase for a certain targeted protein, improving the binding affinities towards the target protein and the E3 ligase, and optimizing the PROTAC linker. However, it is well known that due to the large sizes of PROTAC molecules, their cellular uptake level remains an issue, posing a challenge to translate PROTACs into therapeutics. Driven by our fundamental investigation to compare how different warhead chemistry, reversible noncovalent (RNC), reversible covalent (RC), and irreversible covalent (IRC) binders, may affect the degradation of a model protein Bruton’s Tyrosine Kinase (BTK), we serendipitously discovered that cyano-acrylamide-based reversible covalent chemistry can significantly enhance the intracellular concentration and target engagement of the PROTAC. Building on this discovery, we developed RC-1 as the first reversible covalent BTK PROTAC, which has high target occupancy and is effective as both an inhibitor and a degrader. Molecular dynamics calculations and phase-separation based ternary complex assays support that RC-1 forms a stable ternary complex with BTK and Cereblon (CRBN). Additionally, RC-1 compares favorably with other reported BTK degraders in cell viability and target engagement assays and has a reasonable plasma half-life for in vivo applications. Importantly, this reversible covalent strategy can be generalized and applied to improve other PROTACs. This work can not only help to develop optimal BTK degraders for clinical applications but also provide a new strategy to improve PROTAC efficacy.

Developing highly stable materials for harmful compound detection in a water environment is of much importance and challenge. we report two cadmium based fluorescent coordination compounds with formula [Cd(HL)(phen)(H2O)3] (1) and [Cd(HL)(2,2′-bipy)(H2O)2] (2) where H3L = 4-(N,N'-bis(4-carbonylbenzyl)amino)-3-methylbenzenesulfonic acid, phen = 1,10-phenanthroline monohydrate and 2, 2′-bipy = 2, 2′-bipyridine. Details structural studies showed that compounds 1 and 2 are mononuclear and binuclear discrete compounds, respectively. Its excellent luminescence stability in aqueous solutions, coupled with outstanding thermal and chemical stabilities, enables it to function as an efficient detector for metamitron (MMT). It boasts a limit of detection of 2.72 ppm and exhibits quenching constant (KSV) values of 0.09, making it an effective luminescent sensor for detecting MMT. The luminescence quenching of the compound 1 by MMT was attributed to competing absorption and photoelectron energy transfer mechanisms.