Lysine Acetylation Catalog Covalent posttranslational modification is an essential cellular regulatory mechanism by which the activity of proteins can be controlled. Advances in mass spectrometry made it possible for Choudhary et al. (p. 834 , published online 16 July) to assess the prevalence of lysine acetylation throughout the whole proteome. Acetylation is much more widespread than previously appreciated and occurs on proteins participating in all sorts of biological functions. Acetylation can influence susceptibility of proteins to phosphorylation and occurs frequently on enzymes that control the modification of other proteins by covalent ubiquitination and on proteins that form large macromolecular complexes. The findings also help to characterize the actions of lysine deacetylase inhibitors, which have shown clinical promise in treatments for cancer.

Phosphorylation of an autophagy receptor restricts pathogenic cytosolic bacterial growth.

Post-translational modification of proteins by ubiquitin is a fundamentally important regulatory mechanism. However, proteome-wide analysis of endogenous ubiquitylation remains a challenging task, and almost always has relied on cells expressing affinity tagged ubiquitin. Here we combine single-step immunoenrichment of ubiquitylated peptides with peptide fractionation and high-resolution mass spectrometry to investigate endogenous ubiquitylation sites. We precisely map 11,054 endogenous putative ubiquitylation sites (diglycine-modified lysines) on 4,273 human proteins. The presented data set covers 67% of the known ubiquitylation sites and contains 10,254 novel sites on proteins with diverse cellular functions including cell signaling, receptor endocytosis, DNA replication, DNA damage repair, and cell cycle progression. Our method enables site-specific quantification of ubiquitylation in response to cellular perturbations and is applicable to any cell type or tissue. Global quantification of ubiquitylation in cells treated with the proteasome inhibitor MG-132 discovers sites that are involved in proteasomal degradation, and suggests a nonproteasomal function for almost half of all sites. Surprisingly, ubiquitylation of about 15% of sites decreased more than twofold within four hours of MG-132 treatment, showing that inhibition of proteasomal function can dramatically reduce ubiquitylation on many sites with non-proteasomal functions. Comparison of ubiquitylation sites with acetylation sites reveals an extensive overlap between the lysine residues targeted by these two modifications. However, the crosstalk between these two post-translational modifications is significantly less frequent on sites that show increased ubiquitylation upon proteasome inhibition. Taken together, we report the largest site-specific ubiquitylation dataset in human cells, and for the first time demonstrate proteome-wide, site-specific quantification of endogenous putative ubiquitylation sites. Post-translational modification of proteins by ubiquitin is a fundamentally important regulatory mechanism. However, proteome-wide analysis of endogenous ubiquitylation remains a challenging task, and almost always has relied on cells expressing affinity tagged ubiquitin. Here we combine single-step immunoenrichment of ubiquitylated peptides with peptide fractionation and high-resolution mass spectrometry to investigate endogenous ubiquitylation sites. We precisely map 11,054 endogenous putative ubiquitylation sites (diglycine-modified lysines) on 4,273 human proteins. The presented data set covers 67% of the known ubiquitylation sites and contains 10,254 novel sites on proteins with diverse cellular functions including cell signaling, receptor endocytosis, DNA replication, DNA damage repair, and cell cycle progression. Our method enables site-specific quantification of ubiquitylation in response to cellular perturbations and is applicable to any cell type or tissue. Global quantification of ubiquitylation in cells treated with the proteasome inhibitor MG-132 discovers sites that are involved in proteasomal degradation, and suggests a nonproteasomal function for almost half of all sites. Surprisingly, ubiquitylation of about 15% of sites decreased more than twofold within four hours of MG-132 treatment, showing that inhibition of proteasomal function can dramatically reduce ubiquitylation on many sites with non-proteasomal functions. Comparison of ubiquitylation sites with acetylation sites reveals an extensive overlap between the lysine residues targeted by these two modifications. However, the crosstalk between these two post-translational modifications is significantly less frequent on sites that show increased ubiquitylation upon proteasome inhibition. Taken together, we report the largest site-specific ubiquitylation dataset in human cells, and for the first time demonstrate proteome-wide, site-specific quantification of endogenous putative ubiquitylation sites. Ubiquitin is a 76 amino acid long protein that can be conjugated to the ε-amino group of lysines in a process termed ubiquitylation or ubiquitination (1Glickman M.H. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.Nat. Rev. 2002; 82: 373-428Google Scholar, 2Weissman A.M. Themes and variations on ubiquitylation.Mol. Cell Biol. 2001; 2: 169-178Google Scholar). Post-translational modification (PTM) 1The abbreviations used are:PTMpost-translational modificationUPSubiquitin proteasome systemSILACstable isotope labeling by amino acids in cell cultureHCDhigher-energy C-trap dissociationGOgene ontologyRTKreceptor tyrosine kinasedi-Glydi-glycine. of proteins by ubiquitin is a reversible regulatory mechanism that is well conserved in eukaryotic organisms. The role of ubiquitylation is extensively studied in the ubiquitin proteasome system (UPS) where substrate-linked ubiquitin provides a signal for proteasomal degradation of target proteins (3Hochstrasser M. Ubiquitin, proteasomes, and the regulation of intracellular protein degradation.Current Opinion Cell Biol. 1995; 7: 215-223Crossref PubMed Scopus (780) Google Scholar). However, ubiquitylation also plays important roles in many other cellular processes including DNA damage repair, DNA replication, cell surface receptor endocytosis, and innate immune signaling (4Chen Z.J. Sun L.J. Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling.Mol. Cell. 2009; 33: 275-286Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (684) Google Scholar, 5Grabbe C. Husnjak K. Dikic I. The spatial and temporal organization of ubiquitin networks.Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2011; 12: 295-307Crossref PubMed Scopus (251) Google Scholar, 6Mukhopadhyay D. Riezman H. Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling.Science. 2007; 315: 201-205Crossref PubMed Scopus (938) Google Scholar). Deregulation of the UPS has been implicated in the development of cancer and neurodegenerative disorders (7Bingol B. Sheng M. Deconstruction for reconstruction: the role of proteolysis in neural plasticity and disease.Neuron. 2011; 69: 22-32Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (216) Google Scholar, 8Hoeller D. Hecker C.M. Dikic I. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins in cancer pathogenesis.Nat. Rev. 2006; 6: 776-788Crossref Scopus (323) Google Scholar, 9Schwartz A.L. Ciechanover A. Targeting proteins for destruction by the ubiquitin system: implications for human pathobiology.Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2009; 49: 73-96Crossref PubMed Scopus (352) Google Scholar). The clinical use of the proteasome inhibitor bortezomib, and ongoing clinical trials of several other inhibitors emphasize the therapeutic relevance of the UPS (10Bedford L. Lowe J. Dick L.R. Mayer R.J. Brownell J.E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.Nat. Rev. 2011; 10: 29-46Google Scholar, 11Hoeller D. Dikic I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.Nature. 2009; 458: 438-444Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar).Accurate mapping of PTM sites is a key requirement to determine their functional roles and to understand the regulatory complexity of the proteome. Advancements in high resolution mass spectrometry (MS)-based proteomics have enabled the identification of thousands of in vivo PTMs (12Choudhary C. Mann M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.Nat. Rev. 2010; 11: 427-439Crossref Scopus (475) Google Scholar). Quantitative proteomics can be used to analyze relative changes in PTM abundance on a global scale, enabling the identification of perturbation-relevant regulatory sites in complex signaling networks.Identification of ubiquitylation sites by mass spectrometry is based on the presence of a di-glycine (di-Gly) remnant on ubiquitylated lysines. The di-Gly remnant is derived from the two C-terminal glycine residues of ubiquitin that remain covalently linked to modified lysines following proteolytic digestion with trypsin. The distinct mass shift (114.0429 Da) caused by the di-Gly remnant enables identification and precise localization of ubiquitylation sites based on peptide fragment masses. Trypsin proteolysis of proteins modified by ubiquitin, NEDD8, or ISG15 generates an identical di-Gly remnant on modified lysines, making it impossible to distinguish among these modifications by mass spectrometry. However, the expression of ISG15 and its conjugation to lysines is relatively low in cells cultured under standard cell culture conditions (13Zhang D. Zhang D.E. Interferon-stimulated gene 15 and the protein ISGylation system.J. Interferon Cytokine Res. 2011; 31: 119-130Crossref PubMed Scopus (224) Google Scholar), and NEDD8 is believed to target primarily cullin family proteins (14Rabut G. Peter M. Function and regulation of protein neddylation. ‘Protein modifications: beyond the usual suspects' review series.EMBO Rep. 2008; 9: 969-976Crossref PubMed Scopus (258) Google Scholar). Consequently, a great majority of cellular peptides containing the di-Gly remnant are believed to stem from ubiquitylated proteins. Therefore, in this paper we refer to all di-Gly modified lysines as “ubiquitylation sites” even though a small fraction of these sites is likely to originate from modification by ISG15 or NEDD8.Large-scale ubiquitylation site mapping by mass spectrometry was first demonstrated in yeast by identifying over 100 ubiquitylation sites (15Peng J. Schwartz D. Elias J.E. Thoreen C.C. Cheng D. Marsischky G. Roelofs J. Finley D. Gygi S.P. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.Nat. Biotechnol. 2003; 21: 921-926Crossref PubMed Scopus (1291) Google Scholar). Since then four large-scale ubiquitylation screens have mapped 1,192 sites in human cells (16Danielsen J.M. Sylvestersen K.B. Bekker-Jensen S. Szklarczyk D. Poulsen J.W. Horn H. Jensen L.J. Mailand N. Nielsen M.L. Mass spectrometric analysis of lysine ubiquitylation reveals promiscuity at site level.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M110.003590)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (247) Google Scholar, 17Xu G. Paige J.S. Jaffrey S.R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.Nat. Biotechnol. 2010; 28: 868-873Crossref PubMed Scopus (386) Google Scholar, 18Meierhofer D. Wang X. Huang L. Kaiser P. Quantitative analysis of global ubiquitination in HeLa cells by mass spectrometry.J. Proteome Res. 2008; 7: 4566-4576Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar, 19Shi Y. Chan D.W. Jung S.Y. Malovannaya A. Wang Y. Qin J. A dataset of human endogenous ubiquitination sites.Mol. Cell. Proteomics. 2010; 10 (M110.002089)PubMed Google Scholar). The methods used in all these studies require enrichment of ubiquitylated proteins. Although, many putatively ubiquitylated proteins were identified (16Danielsen J.M. Sylvestersen K.B. Bekker-Jensen S. Szklarczyk D. Poulsen J.W. Horn H. Jensen L.J. Mailand N. Nielsen M.L. Mass spectrometric analysis of lysine ubiquitylation reveals promiscuity at site level.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M110.003590)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (247) Google Scholar), only a relatively small number of ubiquitylation sites were mapped. Limitations of previous methods for in-depth ubiquitylation analysis and their incompatibility with a proteome-wide, site-specific quantification highlighted the need to develop more robust methods of ubiquitylation site identification and quantification.In this study we developed a streamlined method in which ubiquitylated peptides are directly enriched from trypsin digested whole cell peptide mixture with a recently developed di-Gly-lysine-specific antibody (17Xu G. Paige J.S. Jaffrey S.R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.Nat. Biotechnol. 2010; 28: 868-873Crossref PubMed Scopus (386) Google Scholar). Direct immunoenrichment of ubiquitylated peptides, together with peptide fractionation and high resolution mass spectrometery, allowed in-depth analysis of putative ubiquitylation sites. Using this method we identified a considerable portion of previously known human ubiquitylation sites, and discovered more than 10,000 additional sites. Furthermore, we combined our method with stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to quantify changes in ubiquitylation in response to the proteasome inhibitor MG-132. The described method enables proteome-wide quantification of endogenous ubiquitylation sites in response to different cellular perturbations.DISCUSSIONProtein phosphorylation is one of the most extensively studied post-translational modifications in eukaryotes. The human genome encodes about 518 protein kinases (54Manning G. Whyte D.B. Martinez R. Hunter T. Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome.Science. 2002; 298: 1912-1934Crossref PubMed Scopus (6126) Google Scholar), 107 tyrosine phosphatases (55Alonso A. Sasin J. Bottini N. Friedberg I. Friedberg I. Osterman A. Godzik A. Hunter T. Dixon J. Mustelin T. Protein tyrosine phosphatases in the human genome.Cell. 2004; 117: 699-711Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1502) Google Scholar), and nearly 30 serine threonine phosphatases (56Shi Y. Serine/threonine phosphatases: mechanism through structure.Cell. 2009; 139: 468-484Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1024) Google Scholar). Similarly, in human cells 650 different E1, E2, and E3 enzymes are involved in ubiquitylation (57Bhoj V.G. Chen Z.J. Ubiquitylation in innate and adaptive immunity.Nature. 2009; 458: 430-437Crossref PubMed Scopus (447) Google Scholar), and about 100 deubiquitylases reverse this modification (57Bhoj V.G. Chen Z.J. Ubiquitylation in innate and adaptive immunity.Nature. 2009; 458: 430-437Crossref PubMed Scopus (447) Google Scholar, 58Nijman S.M. Luna-Vargas M.P. Velds A. Brummelkamp T.R. Dirac A.M. Sixma T.K. Bernards R. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes.Cell. 2005; 123: 773-786Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1385) Google Scholar). The presence of this extensive ubiquitylation machinery in human cells suggests that the complexity of protein regulation by ubiquitylation could be comparable to that of phosphorylation. However, owing to technological challenges, the number of known ubiquitylation sites was limited in comparison to the number of known phosphorylation sites. In previously described methods identification of ubiquitylation sites entails enrichment of ubiquitylated proteins, often modified by ectopically expressed, affinity-tagged ubiquitin. Trypsin digestion of these proteins generates a complex peptide mixture containing a small fraction of ubiquitylated peptides.In this study we applied a highly robust and streamlined proteomic method to precisely map endogenous putative ubiquitylation sites in human cells. Our approach provides several advantages over previously described MS-based methods for ubiquitylation site mapping: (1) it only requires a single-step affinity enrichment of modified peptides, (2) the highly efficient enrichment of ubiquitylated peptides enables detection of low abundant modification sites, (3) it allows in-depth, proteome-wide analysis of endogenous ubiquitylation sites, (4) it can be easily applied to map ubiquitylation sites in any tissue or organism, and (5) it is fully compatible with site-specific quantification of ubiquitylation on a proteome-wide level.Using this approach we identified 11,054 putative endogenous ubiquitylation sites (diglycine-modified lysines) in human cells. These data cover over two-thirds of the sites reported in previous MS-based studies. However, more than 90% of the sites in our dataset had not been reported previously. Thus, these data substantially expand the number of currently known human ubiquitylation sites. This study establishes ubiquitylation, in terms of identified sites, as the second most comprehensively studied PTM after phosphorylation. We show that ubiquitylation targets proteins involved in all major cellular functions and that its regulatory scope is comparable to other PTMs such as phosphorylation and acetylation. The described approach enables proteome-wide, quantitative analysis of ubiquitylation for the first time. Our analysis of changes in ubiquitylation following proteasome inhibition demonstrated that about half of all sites show increased ubiquitylation, whereas a subset of nuclear proteins is affected by reduced ubiquitylation, after just four hours of proteasome inhibition. It remains unclear whether sites that show increased ubiquitylation after MG-132 treatment are directly involved in proteasomal degradation. However, it is tempting to speculate that sites that do not show increased ubiquitylation upon proteasome inhibition confer nonproteasomal regulatory functions.The sites identified in this study will serve as a valuable resource for the functional characterization of many proteins. The described method is generic and can be easily applied to map ubiquitylation sites in any cell type, tissue, or organism, and to perform site-specific quantification of ubiquitylation upon cellular perturbations.Data availability: Sequence spectra supporting identification of ubiquitylated peptides, as well as all raw data associated with this manuscript can be downloaded from ProteomeCommons.org Tranche (https://proteomecommons.org/tranche) using hash keys and passphrases provided below. Dataset 1.1 and 1.2 contain 34 raw files. These files contain all data obtained from HEK293T cells. Dataset 2 contains 16 raw files, which include all SILAC quantification data from MV4–11 cells. The PDF document “MS2 Spectra” contains annotated MS2 spectra of ubiquitylated peptides identified in this study. Hash keys and passphrasesDataset 1.1Hash: H0o4Cai+TnsiC3Af0YIzJFfwq7XQfbBoHQLxCUPEwY96seDEnTx0qRXRqChGWoN//1V0wiMYYrmJDjgpcE+gfQSRy34AAAAAAAAMEw==Passphrase: Cmze4ltlmlGZELQXLvEFDataset 1.2Hash: 8yPGbBGmgl+zsKcGvnZZGa48YTy0wmTp98DxkFh5pRkic7Mu8lukNUms6cIGXw4V00HsYFuaVFJCIgmLsUp/6g+l90oAAAAAAAASlA==Passphrase: Kex25oTVPRr13TKfa6zEDataset 2Hash: /sglfTBfdJ8KarJM4cL9JS9FAen9/rgmjL0i3nkDzz3wtOsQSPpPd2hBxspbY7ueLjXYcIutUYT1+tkwlHi306BwKLYAAAAAAAAOfw==Passphrase: FP2MHaGhH5oIEfynQps3MS2 SpectraHash: 2RHwSnV7v8LETS3AmNgEOFmjnOh5J8uvDtEQS/2JTH//ZzZM7QPpBqcVo5EOOYjFHWIDMk7kkY+8OFSp+9iTOO/XJFIAAAAAAAACQA==Passphrase: ueN0KgNiypPTF9rY97XL Ubiquitin is a 76 amino acid long protein that can be conjugated to the ε-amino group of lysines in a process termed ubiquitylation or ubiquitination (1Glickman M.H. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.Nat. Rev. 2002; 82: 373-428Google Scholar, 2Weissman A.M. Themes and variations on ubiquitylation.Mol. Cell Biol. 2001; 2: 169-178Google Scholar). Post-translational modification (PTM) 1The abbreviations used are:PTMpost-translational modificationUPSubiquitin proteasome systemSILACstable isotope labeling by amino acids in cell cultureHCDhigher-energy C-trap dissociationGOgene ontologyRTKreceptor tyrosine kinasedi-Glydi-glycine. of proteins by ubiquitin is a reversible regulatory mechanism that is well conserved in eukaryotic organisms. The role of ubiquitylation is extensively studied in the ubiquitin proteasome system (UPS) where substrate-linked ubiquitin provides a signal for proteasomal degradation of target proteins (3Hochstrasser M. Ubiquitin, proteasomes, and the regulation of intracellular protein degradation.Current Opinion Cell Biol. 1995; 7: 215-223Crossref PubMed Scopus (780) Google Scholar). However, ubiquitylation also plays important roles in many other cellular processes including DNA damage repair, DNA replication, cell surface receptor endocytosis, and innate immune signaling (4Chen Z.J. Sun L.J. Nonproteolytic functions of ubiquitin in cell signaling.Mol. Cell. 2009; 33: 275-286Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (684) Google Scholar, 5Grabbe C. Husnjak K. Dikic I. The spatial and temporal organization of ubiquitin networks.Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2011; 12: 295-307Crossref PubMed Scopus (251) Google Scholar, 6Mukhopadhyay D. Riezman H. Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling.Science. 2007; 315: 201-205Crossref PubMed Scopus (938) Google Scholar). Deregulation of the UPS has been implicated in the development of cancer and neurodegenerative disorders (7Bingol B. Sheng M. Deconstruction for reconstruction: the role of proteolysis in neural plasticity and disease.Neuron. 2011; 69: 22-32Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (216) Google Scholar, 8Hoeller D. Hecker C.M. Dikic I. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins in cancer pathogenesis.Nat. Rev. 2006; 6: 776-788Crossref Scopus (323) Google Scholar, 9Schwartz A.L. Ciechanover A. Targeting proteins for destruction by the ubiquitin system: implications for human pathobiology.Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2009; 49: 73-96Crossref PubMed Scopus (352) Google Scholar). The clinical use of the proteasome inhibitor bortezomib, and ongoing clinical trials of several other inhibitors emphasize the therapeutic relevance of the UPS (10Bedford L. Lowe J. Dick L.R. Mayer R.J. Brownell J.E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.Nat. Rev. 2011; 10: 29-46Google Scholar, 11Hoeller D. Dikic I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.Nature. 2009; 458: 438-444Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar). post-translational modification ubiquitin proteasome system stable isotope labeling by amino acids in cell culture higher-energy C-trap dissociation gene ontology receptor tyrosine kinase di-glycine. Accurate mapping of PTM sites is a key requirement to determine their functional roles and to understand the regulatory complexity of the proteome. Advancements in high resolution mass spectrometry (MS)-based proteomics have enabled the identification of thousands of in vivo PTMs (12Choudhary C. Mann M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.Nat. Rev. 2010; 11: 427-439Crossref Scopus (475) Google Scholar). Quantitative proteomics can be used to analyze relative changes in PTM abundance on a global scale, enabling the identification of perturbation-relevant regulatory sites in complex signaling networks. Identification of ubiquitylation sites by mass spectrometry is based on the presence of a di-glycine (di-Gly) remnant on ubiquitylated lysines. The di-Gly remnant is derived from the two C-terminal glycine residues of ubiquitin that remain covalently linked to modified lysines following proteolytic digestion with trypsin. The distinct mass shift (114.0429 Da) caused by the di-Gly remnant enables identification and precise localization of ubiquitylation sites based on peptide fragment masses. Trypsin proteolysis of proteins modified by ubiquitin, NEDD8, or ISG15 generates an identical di-Gly remnant on modified lysines, making it impossible to distinguish among these modifications by mass spectrometry. However, the expression of ISG15 and its conjugation to lysines is relatively low in cells cultured under standard cell culture conditions (13Zhang D. Zhang D.E. Interferon-stimulated gene 15 and the protein ISGylation system.J. Interferon Cytokine Res. 2011; 31: 119-130Crossref PubMed Scopus (224) Google Scholar), and NEDD8 is believed to target primarily cullin family proteins (14Rabut G. Peter M. Function and regulation of protein neddylation. ‘Protein modifications: beyond the usual suspects' review series.EMBO Rep. 2008; 9: 969-976Crossref PubMed Scopus (258) Google Scholar). Consequently, a great majority of cellular peptides containing the di-Gly remnant are believed to stem from ubiquitylated proteins. Therefore, in this paper we refer to all di-Gly modified lysines as “ubiquitylation sites” even though a small fraction of these sites is likely to originate from modification by ISG15 or NEDD8. Large-scale ubiquitylation site mapping by mass spectrometry was first demonstrated in yeast by identifying over 100 ubiquitylation sites (15Peng J. Schwartz D. Elias J.E. Thoreen C.C. Cheng D. Marsischky G. Roelofs J. Finley D. Gygi S.P. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.Nat. Biotechnol. 2003; 21: 921-926Crossref PubMed Scopus (1291) Google Scholar). Since then four large-scale ubiquitylation screens have mapped 1,192 sites in human cells (16Danielsen J.M. Sylvestersen K.B. Bekker-Jensen S. Szklarczyk D. Poulsen J.W. Horn H. Jensen L.J. Mailand N. Nielsen M.L. Mass spectrometric analysis of lysine ubiquitylation reveals promiscuity at site level.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M110.003590)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (247) Google Scholar, 17Xu G. Paige J.S. Jaffrey S.R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.Nat. Biotechnol. 2010; 28: 868-873Crossref PubMed Scopus (386) Google Scholar, 18Meierhofer D. Wang X. Huang L. Kaiser P. Quantitative analysis of global ubiquitination in HeLa cells by mass spectrometry.J. Proteome Res. 2008; 7: 4566-4576Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar, 19Shi Y. Chan D.W. Jung S.Y. Malovannaya A. Wang Y. Qin J. A dataset of human endogenous ubiquitination sites.Mol. Cell. Proteomics. 2010; 10 (M110.002089)PubMed Google Scholar). The methods used in all these studies require enrichment of ubiquitylated proteins. Although, many putatively ubiquitylated proteins were identified (16Danielsen J.M. Sylvestersen K.B. Bekker-Jensen S. Szklarczyk D. Poulsen J.W. Horn H. Jensen L.J. Mailand N. Nielsen M.L. Mass spectrometric analysis of lysine ubiquitylation reveals promiscuity at site level.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M110.003590)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (247) Google Scholar), only a relatively small number of ubiquitylation sites were mapped. Limitations of previous methods for in-depth ubiquitylation analysis and their incompatibility with a proteome-wide, site-specific quantification highlighted the need to develop more robust methods of ubiquitylation site identification and quantification. In this study we developed a streamlined method in which ubiquitylated peptides are directly enriched from trypsin digested whole cell peptide mixture with a recently developed di-Gly-lysine-specific antibody (17Xu G. Paige J.S. Jaffrey S.R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.Nat. Biotechnol. 2010; 28: 868-873Crossref PubMed Scopus (386) Google Scholar). Direct immunoenrichment of ubiquitylated peptides, together with peptide fractionation and high resolution mass spectrometery, allowed in-depth analysis of putative ubiquitylation sites. Using this method we identified a considerable portion of previously known human ubiquitylation sites, and discovered more than 10,000 additional sites. Furthermore, we combined our method with stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to quantify changes in ubiquitylation in response to the proteasome inhibitor MG-132. The described method enables proteome-wide quantification of endogenous ubiquitylation sites in response to different cellular perturbations. DISCUSSIONProtein phosphorylation is one of the most extensively studied post-translational modifications in eukaryotes. The human genome encodes about 518 protein kinases (54Manning G. Whyte D.B. Martinez R. Hunter T. Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome.Science. 2002; 298: 1912-1934Crossref PubMed Scopus (6126) Google Scholar), 107 tyrosine phosphatases (55Alonso A. Sasin J. Bottini N. Friedberg I. Friedberg I. Osterman A. Godzik A. Hunter T. Dixon J. Mustelin T. Protein tyrosine phosphatases in the human genome.Cell. 2004; 117: 699-711Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1502) Google Scholar), and nearly 30 serine threonine phosphatases (56Shi Y. Serine/threonine phosphatases: mechanism through structure.Cell. 2009; 139: 468-484Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1024) Google Scholar). Similarly, in human cells 650 different E1, E2, and E3 enzymes are involved in ubiquitylation (57Bhoj V.G. Chen Z.J. Ubiquitylation in innate and adaptive immunity.Nature. 2009; 458: 430-437Crossref PubMed Scopus (447) Google Scholar), and about 100 deubiquitylases reverse this modification (57Bhoj V.G. Chen Z.J. Ubiquitylation in innate and adaptive immunity.Nature. 2009; 458: 430-437Crossref PubMed Scopus (447) Google Scholar, 58Nijman S.M. Luna-Vargas M.P. Velds A. Brummelkamp T.R. Dirac A.M. Sixma T.K. Bernards R. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes.Cell. 2005; 123: 773-786Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1385) Google Scholar). The presence of this extensive ubiquitylation machinery in human cells suggests that the complexity of protein regulation by ubiquitylation could be comparable to that of phosphorylation. However, owing to technological challenges, the number of known ubiquitylation sites was limited in comparison to the number of known phosphorylation sites. In previously described methods identification of ubiquitylation sites entails enrichment of ubiquitylated proteins, often modified by ectopically expressed, affinity-tagged ubiquitin. Trypsin digestion of these proteins generates a complex peptide mixture containing a small fraction of ubiquitylated peptides.In this study we applied a highly robust and streamlined proteomic method to precisely map endogenous putative ubiquitylation sites in human cells. Our approach provides several advantages over previously described MS-based methods for ubiquitylation site mapping: (1) it only requires a single-step affinity enrichment of modified peptides, (2) the highly efficient enrichment of ubiquitylated peptides enables detection of low abundant modification sites, (3) it allows in-depth, proteome-wide analysis of endogenous ubiquitylation sites, (4) it can be easily applied to map ubiquitylation sites in any tissue or organism, and (5) it is fully compatible with site-specific quantification of ubiquitylation on a proteome-wide level.Using this approach we identified 11,054 putative endogenous ubiquitylation sites (diglycine-modified lysines) in human cells. These data cover over two-thirds of the sites reported in previous MS-based studies. However, more than 90% of the sites in our dataset had not been reported previously. Thus, these data substantially expand the number of currently known human ubiquitylation sites. This study establishes ubiquitylation, in terms of identified sites, as the second most comprehensively studied PTM after phosphorylation. We show that ubiquitylation targets proteins involved in all major cellular functions and that its regulatory scope is comparable to other PTMs such as phosphorylation and acetylation. The described approach enables proteome-wide, quantitative analysis of ubiquitylation for the first time. Our analysis of changes in ubiquitylation following proteasome inhibition demonstrated that about half of all sites show increased ubiquitylation, whereas a subset of nuclear proteins is affected by reduced ubiquitylation, after just four hours of proteasome inhibition. It remains unclear whether sites that show increased ubiquitylation after MG-132 treatment are directly involved in proteasomal degradation. However, it is tempting to speculate that sites that do not show increased ubiquitylation upon proteasome inhibition confer nonproteasomal regulatory functions.The sites identified in this study will serve as a valuable resource for the functional characterization of many proteins. The described method is generic and can be easily applied to map ubiquitylation sites in any cell type, tissue, or organism, and to perform site-specific quantification of ubiquitylation upon cellular perturbations.Data availability: Sequence spectra supporting identification of ubiquitylated peptides, as well as all raw data associated with this manuscript can be downloaded from ProteomeCommons.org Tranche (https://proteomecommons.org/tranche) using hash keys and passphrases provided below. Dataset 1.1 and 1.2 contain 34 raw files. These files contain all data obtained from HEK293T cells. Dataset 2 contains 16 raw files, which include all SILAC quantification data from MV4–11 cells. The PDF document “MS2 Spectra” contains annotated MS2 spectra of ubiquitylated peptides identified in this study. Hash keys and passphrasesDataset 1.1Hash: H0o4Cai+TnsiC3Af0YIzJFfwq7XQfbBoHQLxCUPEwY96seDEnTx0qRXRqChGWoN//1V0wiMYYrmJDjgpcE+gfQSRy34AAAAAAAAMEw==Passphrase: Cmze4ltlmlGZELQXLvEFDataset 1.2Hash: 8yPGbBGmgl+zsKcGvnZZGa48YTy0wmTp98DxkFh5pRkic7Mu8lukNUms6cIGXw4V00HsYFuaVFJCIgmLsUp/6g+l90oAAAAAAAASlA==Passphrase: Kex25oTVPRr13TKfa6zEDataset 2Hash: /sglfTBfdJ8KarJM4cL9JS9FAen9/rgmjL0i3nkDzz3wtOsQSPpPd2hBxspbY7ueLjXYcIutUYT1+tkwlHi306BwKLYAAAAAAAAOfw==Passphrase: FP2MHaGhH5oIEfynQps3MS2 SpectraHash: 2RHwSnV7v8LETS3AmNgEOFmjnOh5J8uvDtEQS/2JTH//ZzZM7QPpBqcVo5EOOYjFHWIDMk7kkY+8OFSp+9iTOO/XJFIAAAAAAAACQA==Passphrase: ueN0KgNiypPTF9rY97XL Protein phosphorylation is one of the most extensively studied post-translational modifications in eukaryotes. The human genome encodes about 518 protein kinases (54Manning G. Whyte D.B. Martinez R. Hunter T. Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome.Science. 2002; 298: 1912-1934Crossref PubMed Scopus (6126) Google Scholar), 107 tyrosine phosphatases (55Alonso A. Sasin J. Bottini N. Friedberg I. Friedberg I. Osterman A. Godzik A. Hunter T. Dixon J. Mustelin T. Protein tyrosine phosphatases in the human genome.Cell. 2004; 117: 699-711Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1502) Google Scholar), and nearly 30 serine threonine phosphatases (56Shi Y. Serine/threonine phosphatases: mechanism through structure.Cell. 2009; 139: 468-484Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1024) Google Scholar). Similarly, in human cells 650 different E1, E2, and E3 enzymes are involved in ubiquitylation (57Bhoj V.G. Chen Z.J. Ubiquitylation in innate and adaptive immunity.Nature. 2009; 458: 430-437Crossref PubMed Scopus (447) Google Scholar), and about 100 deubiquitylases reverse this modification (57Bhoj V.G. Chen Z.J. Ubiquitylation in innate and adaptive immunity.Nature. 2009; 458: 430-437Crossref PubMed Scopus (447) Google Scholar, 58Nijman S.M. Luna-Vargas M.P. Velds A. Brummelkamp T.R. Dirac A.M. Sixma T.K. Bernards R. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes.Cell. 2005; 123: 773-786Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1385) Google Scholar). The presence of this extensive ubiquitylation machinery in human cells suggests that the complexity of protein regulation by ubiquitylation could be comparable to that of phosphorylation. However, owing to technological challenges, the number of known ubiquitylation sites was limited in comparison to the number of known phosphorylation sites. In previously described methods identification of ubiquitylation sites entails enrichment of ubiquitylated proteins, often modified by ectopically expressed, affinity-tagged ubiquitin. Trypsin digestion of these proteins generates a complex peptide mixture containing a small fraction of ubiquitylated peptides. In this study we applied a highly robust and streamlined proteomic method to precisely map endogenous putative ubiquitylation sites in human cells. Our approach provides several advantages over previously described MS-based methods for ubiquitylation site mapping: (1) it only requires a single-step affinity enrichment of modified peptides, (2) the highly efficient enrichment of ubiquitylated peptides enables detection of low abundant modification sites, (3) it allows in-depth, proteome-wide analysis of endogenous ubiquitylation sites, (4) it can be easily applied to map ubiquitylation sites in any tissue or organism, and (5) it is fully compatible with site-specific quantification of ubiquitylation on a proteome-wide level. Using this approach we identified 11,054 putative endogenous ubiquitylation sites (diglycine-modified lysines) in human cells. These data cover over two-thirds of the sites reported in previous MS-based studies. However, more than 90% of the sites in our dataset had not been reported previously. Thus, these data substantially expand the number of currently known human ubiquitylation sites. This study establishes ubiquitylation, in terms of identified sites, as the second most comprehensively studied PTM after phosphorylation. We show that ubiquitylation targets proteins involved in all major cellular functions and that its regulatory scope is comparable to other PTMs such as phosphorylation and acetylation. The described approach enables proteome-wide, quantitative analysis of ubiquitylation for the first time. Our analysis of changes in ubiquitylation following proteasome inhibition demonstrated that about half of all sites show increased ubiquitylation, whereas a subset of nuclear proteins is affected by reduced ubiquitylation, after just four hours of proteasome inhibition. It remains unclear whether sites that show increased ubiquitylation after MG-132 treatment are directly involved in proteasomal degradation. However, it is tempting to speculate that sites that do not show increased ubiquitylation upon proteasome inhibition confer nonproteasomal regulatory functions. The sites identified in this study will serve as a valuable resource for the functional characterization of many proteins. The described method is generic and can be easily applied to map ubiquitylation sites in any cell type, tissue, or organism, and to perform site-specific quantification of ubiquitylation upon cellular perturbations. Data availability: Sequence spectra supporting identification of ubiquitylated peptides, as well as all raw data associated with this manuscript can be downloaded from ProteomeCommons.org Tranche (https://proteomecommons.org/tranche) using hash keys and passphrases provided below. Dataset 1.1 and 1.2 contain 34 raw files. These files contain all data obtained from HEK293T cells. Dataset 2 contains 16 raw files, which include all SILAC quantification data from MV4–11 cells. The PDF document “MS2 Spectra” contains annotated MS2 spectra of ubiquitylated peptides identified in this study. Hash keys and passphrasesDataset 1.1Hash: H0o4Cai+TnsiC3Af0YIzJFfwq7XQfbBoHQLxCUPEwY96seDEnTx0qRXRqChGWoN//1V0wiMYYrmJDjgpcE+gfQSRy34AAAAAAAAMEw==Passphrase: Cmze4ltlmlGZELQXLvEFDataset 1.2Hash: 8yPGbBGmgl+zsKcGvnZZGa48YTy0wmTp98DxkFh5pRkic7Mu8lukNUms6cIGXw4V00HsYFuaVFJCIgmLsUp/6g+l90oAAAAAAAASlA==Passphrase: Kex25oTVPRr13TKfa6zEDataset 2Hash: /sglfTBfdJ8KarJM4cL9JS9FAen9/rgmjL0i3nkDzz3wtOsQSPpPd2hBxspbY7ueLjXYcIutUYT1+tkwlHi306BwKLYAAAAAAAAOfw==Passphrase: FP2MHaGhH5oIEfynQps3MS2 SpectraHash: 2RHwSnV7v8LETS3AmNgEOFmjnOh5J8uvDtEQS/2JTH//ZzZM7QPpBqcVo5EOOYjFHWIDMk7kkY+8OFSp+9iTOO/XJFIAAAAAAAACQA==Passphrase: ueN0KgNiypPTF9rY97XL Supplementary Material Download .zip (7.13 MB) Help with zip files Download .zip (7.13 MB) Help with zip files

Recent studies have shown that lysines can be posttranslationally modified by various types of acylations. However, except for acetylation, very little is known about their scope and cellular distribution. We mapped thousands of succinylation sites in bacteria (E. coli), yeast (S. cerevisiae), human (HeLa) cells, and mouse liver tissue, demonstrating widespread succinylation in diverse organisms. A majority of succinylation sites in bacteria, yeast, and mouse liver were acetylated at the same position. Quantitative analysis of succinylation in yeast showed that succinylation was globally altered by growth conditions and mutations that affected succinyl-coenzyme A (succinyl-CoA) metabolism in the tricarboxylic acid cycle, indicating that succinylation levels are globally affected by succinyl-CoA concentration. We preferentially detected succinylation on abundant proteins, suggesting that succinylation occurs at a low level and that many succinylation sites remain unidentified. These data provide a systems-wide view of succinylation and its dynamic regulation and show its extensive overlap with acetylation.

A potent and selective catalytic inhibitor of p300/CBP histone acetyltransferases suppresses tumour proliferation across multiple cell lineages, illustrating the therapeutic potential of drug-like small molecules that target histone acetyltransferases. The dynamic and reversible acetylation of proteins, catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), is a major epigenetic regulatory mechanism of gene transcription1 and is associated with multiple diseases. Histone deacetylase inhibitors are currently approved to treat certain cancers, but progress on the development of drug-like histone actyltransferase inhibitors has lagged behind2. The histone acetyltransferase paralogues p300 and CREB-binding protein (CBP) are key transcriptional co-activators that are essential for a multitude of cellular processes, and have also been implicated in human pathological conditions (including cancer3). Current inhibitors of the p300 and CBP histone acetyltransferase domains, including natural products4, bi-substrate analogues5 and the widely used small molecule C6466,7, lack potency or selectivity. Here, we describe A-485, a potent, selective and drug-like catalytic inhibitor of p300 and CBP. We present a high resolution (1.95 Å) co-crystal structure of a small molecule bound to the catalytic active site of p300 and demonstrate that A-485 competes with acetyl coenzyme A (acetyl-CoA). A-485 selectively inhibited proliferation in lineage-specific tumour types, including several haematological malignancies and androgen receptor-positive prostate cancer. A-485 inhibited the androgen receptor transcriptional program in both androgen-sensitive and castration-resistant prostate cancer and inhibited tumour growth in a castration-resistant xenograft model. These results demonstrate the feasibility of using small molecule inhibitors to selectively target the catalytic activity of histone acetyltransferases, which may provide effective treatments for transcriptional activator-driven malignancies and diseases.

Lysine acetylation is a major posttranslational modification involved in a broad array of physiological functions. Here, we provide an organ-wide map of lysine acetylation sites from 16 rat tissues analyzed by high-resolution tandem mass spectrometry. We quantify 15,474 modification sites on 4,541 proteins and provide the data set as a web-based database. We demonstrate that lysine acetylation displays site-specific sequence motifs that diverge between cellular compartments, with a significant fraction of nuclear sites conforming to the consensus motifs G-AcK and AcK-P. Our data set reveals that the subcellular acetylation distribution is tissue-type dependent and that acetylation targets tissue-specific pathways involved in fundamental physiological processes. We compare lysine acetylation patterns for rat as well as human skeletal muscle biopsies and demonstrate its general involvement in muscle contraction. Furthermore, we illustrate that acetylation of fructose-bisphosphate aldolase and glycerol-3-phosphate dehydrogenase serves as a cellular mechanism to switch off enzymatic activity.

Lysine acetylation is a frequently occurring posttranslational modification in bacteria; however, little is known about its origin and regulation. Using the model bacterium Escherichia coli (E. coli), we found that most acetylation occurred at a low level and accumulated in growth-arrested cells in a manner that depended on the formation of acetyl-phosphate (AcP) through glycolysis. Mutant cells unable to produce AcP had significantly reduced acetylation levels, while mutant cells unable to convert AcP to acetate had significantly elevated acetylation levels. We showed that AcP can chemically acetylate lysine residues in vitro and that AcP levels are correlated with acetylation levels in vivo, suggesting that AcP may acetylate proteins nonenzymatically in cells. These results uncover a critical role for AcP in bacterial acetylation and indicate that most acetylation in E. coli occurs at a low level and is dynamically affected by metabolism and cell proliferation in a global, uniform manner.

Repair of damaged DNA is essential for maintaining genome integrity and for preventing genome-instability-associated diseases, such as cancer. By combining proximity labeling with quantitative mass spectrometry, we generated high-resolution interaction neighborhood maps of the endogenously expressed DNA repair factors 53BP1, BRCA1, and MDC1. Our spatially resolved interaction maps reveal rich network intricacies, identify shared and bait-specific interaction modules, and implicate previously concealed regulators in this process. We identified a novel vertebrate-specific protein complex, shieldin, comprising REV7 plus three previously uncharacterized proteins, RINN1 (CTC-534A2.2), RINN2 (FAM35A), and RINN3 (C20ORF196). Recruitment of shieldin to DSBs, via the ATM-RNF8-RNF168-53BP1-RIF1 axis, promotes NHEJ-dependent repair of intrachromosomal breaks, immunoglobulin class-switch recombination (CSR), and fusion of unprotected telomeres. Shieldin functions as a downstream effector of 53BP1-RIF1 in restraining DNA end resection and in sensitizing BRCA1-deficient cells to PARP inhibitors. These findings have implications for understanding cancer-associated PARPi resistance and the evolution of antibody CSR in higher vertebrates.

The acetyltransferases CBP and p300 are multifunctional transcriptional co-activators. Here, we combined quantitative proteomics with CBP/p300-specific catalytic inhibitors, bromodomain inhibitor, and gene knockout to reveal a comprehensive map of regulated acetylation sites and their dynamic turnover rates. CBP/p300 acetylates thousands of sites, including signature histone sites and a multitude of sites on signaling effectors and enhancer-associated transcriptional regulators. Time-resolved acetylome analyses identified a subset of CBP/p300-regulated sites with very rapid (<30 min) acetylation turnover, revealing a dynamic balance between acetylation and deacetylation. Quantification of acetylation, mRNA, and protein abundance after CBP/p300 inhibition reveals a kinetically competent network of gene expression that strictly depends on CBP/p300-catalyzed rapid acetylation. Collectively, our in-depth acetylome analyses reveal systems attributes of CBP/p300 targets, and the resource dataset provides a framework for investigating CBP/p300 functions and for understanding the impact of small-molecule inhibitors targeting its catalytic and bromodomain activities.

UnSIRT6ain Repair Efficient and accurate repair of double-strand DNA breaks is critical for genome stability and involves a process known as homologous recombination. During repair of the sheared ends, the DNA must be resected by trimming one of the two strands on either side of the break. For the repair to be accurate, the remaining single-stranded DNA (ssDNA) has to be bound by the ssDNA-binding protein, RPA, after which the ssDNA can then bind homologous sequences. Kaidi et al. (p. 1348 ) found that the mammalian deacetylase, SIRT6 (which has been implicated in maintaining genome stability), was critical for resection. At sites of DNA damage, SIRT6 deacetylated and activated CtIP (a protein important for resection), ensuring that resection occurred at the appropriate place and time.