Summary Detection of viral DNA by cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a first line of defence leading to the production of type-I interferon (IFN). As HIV-1 is not a strong inducer of IFN we have hypothesised that its capsid cloaks viral DNA from cGAS. To test this we generated defective viral particles by treatment with HIV-1 protease inhibitors or by genetic manipulation of gag . These viruses had defective Gag cleavage, reduced infectivity and diminished capacity to saturate TRIM5α. Importantly, unlike wild-type HIV-1, infection with cleavage defective HIV-1 triggered an IFN response in THP-1 cells and primary human macrophages that was dependent on viral DNA and cGAS. Infection in the presence of the capsid destabilising small molecule PF-74 also induced a cGAS-dependent IFN response. These data demonstrate a protective role for capsid and suggest that antiviral activity of capsid- and protease-targeting antivirals may benefit from enhanced innate and adaptive immunity in vivo .

SUMMARY Pandemic viruses remain a global threat to health and economics but how they adapt to become pandemic remains poorly understood. Here we compare pandemic HIV-1(M) and non-pandemic HIV-(O) and HIV-2 strains finding that non-pandemic HIV replicate poorly in myeloid cell models due to activation of cGAS and TRIM5, and ensuing antiviral responses. We use phylogenetics and viral capsid structural biology to define specific differences between pandemic and non-pandemic HIV capsids and demonstrate that their genetic reversal in HIV-1(M) mutants causes TRIM5, cGAS and innate immune activation. We propose a model in which the parental lineage of pandemic HIV-1(M) has uniquely evolved a dynamic capsid that avoids activation of cGAS and TRIM5 to establish cloaked replication in myeloid cells. The unique adaptations of the pandemic virus lineage suggests a role in effective human-to-human transmissibility and highlight the importance of avoiding innate immune activation during pandemic human-to-human viral transmission.

Abstract The origin and hazardous potential of human mpox is obscured by a lack of genomic data between the 2018, when exportations from Nigeria were recorded, and 2022 when the global outbreak started. Here, 18 genomes from patients across southern Nigeria in 2019/20 reveal multiple lineages of Monkeypox virus have achieved sustained human-to-human transmission, co-existing in humans for several years and accumulating mutations consistent with APOBEC3 activity suggesting the virus in humans is now segregated from its natural reservoir. Remarkably, three genomes have disruptions in the A46R gene, which contributes to innate immune modulation. The data demonstrates that the A.2 lineage, multiply exported to North America since 2021 independently of the global outbreak, has persisted in Nigeria for more than two years prior to its latest exportation. One-Sentence Summary Mpox is now a human diseae evolving in humans with multiple variants taking separate paths towards adaptation, some analogous to those of Variola

Abstract HIV-1 must replicate in cells that are equipped to defend themselves from infection through intracellular innate immune systems. HIV-1 evades innate immune sensing through encapsidated DNA synthesis and encodes accessory genes that antagonize specific antiviral effectors. Here we show that both particle associated, and expressed HIV-1 Vpr, antagonize the stimulatory effect of a variety of pathogen associated molecular patterns by inhibiting IRF3 and NF-κB nuclear transport. Phosphorylation of IRF3 at S396, but not S386, was also inhibited. We propose that, rather than promoting HIV-1 nuclear import, Vpr interacts with karyopherins to disturb their import of IRF3 and NF-κB to promote replication in macrophages. Concordantly, we demonstrate Vpr dependent rescue of HIV-1 replication in human macrophages from inhibition by cGAMP, the product of activated cGAS. We propose a model that unifies Vpr manipulation of nuclear import and inhibition of innate immune activation to promote HIV-1 replication and transmission.

Abstract Background Detection of viruses by host pattern recognition receptors induces the expression of type I interferon (IFN) and IFN-stimulated genes (ISGs), which suppress viral replication. Retroviruses such as HIV-1 are subject to sensing by both RNA and DNA sensors, and whether there are any particular features of the viral genome or reverse transcripts that facilitate or enhance this sensing is currently unknown. Results Whilst investigating the determinants of innate detection of HIV-1 we noticed that infection of THP-1 cells or primary macrophages with a virus expressing Gag fused to a reporter gene (luciferase or GFP) induced a robust IFN and ISG response that was not observed with an equivalent virus with similar genome length and composition, but expressing wild-type Gag. Innate immune activation by Gag-fusion HIV-1 was dependent on reverse transcription and DNA sensor cGAS, suggesting activation of an IFN response by viral DNA. Further investigation of the Gag-fusion viral particles revealed maturation defects, as evidenced by incomplete Gag cleavage and a diminished capacity to saturate restriction factor TRIM5α, likely due to aberrant particle formation. We propose that expression of the Gag fusion protein disturbs the correct cleavage and maturation of wild-type Gag, yielding viral particles that are unable to effectively shield viral DNA from detection by innate sensors including cGAS. Conclusions These data highlight the crucial role of capsid in innate evasion and support growing literature that disruption of Gag cleavage and capsid formation induces a viral DNA- and cGAS-dependent innate immune response. Together these data demonstrate a protective role for capsid and suggest that antiviral activity of capsid-targeting antivirals may benefit from enhanced innate and adaptive immunity in vivo .

Cells are equipped to defend themselves from invading pathogens through sensors such as cGAS, which upon binding DNA induces type I interferon (IFN) expression. Whilst IFNs are crucial for limiting viral infection and activating adaptive immunity, uncontrolled production causes excessive inflammation and autoimmunity. cGAS binds DNA of both pathogenic and cellular origin and its activity is therefore tightly regulated. This is particularly apparent during mitosis, where cGAS association with chromatin following nuclear membrane dissolution and phosphorylation by mitotic kinases negatively regulate enzymatic activity. Here we describe a novel mechanism by which DNA sensing and other innate immune pathways are regulated during cell division, dependent on cyclin dependent kinases (CDK) 4 and 6. Inhibition of CDK4/6 using chemical inhibitors, shRNA-mediated depletion, or overexpression of cellular CDK4/6 inhibitor p16INK4a, greatly enhanced DNA- or cGAMP-induced expression of cytokines and IFN-stimulated genes (ISG). Mechanistically, CDK4/6-dependent inhibition mapped downstream of cytoplasmic signalling events including STING and IRF3 phosphorylation, limiting innate immune induction at the level of IFNβ mRNA expression. This regulation was universal, occurring in primary and transformed cells of human and murine origin, and broad, as IFNβ expression was inhibited in a CDK4/6-dependent manner downstream of multiple pattern recognition receptors. Together these findings demonstrate that host innate responses are limited by multiple mechanisms during cell division, thus defining cellular replication as an innate immune privileged process that may be necessary to avoid aberrant self-recognition and autoimmunity.

Abstract The NF- κ B family of transcription factors and associated signalling pathways are abundant and ubiquitous in human immune responses. Activation of NF- κ B transcription factors by viral pathogen-associated molecular patterns, such as viral RNA and DNA, is fundamental to anti-viral innate immune defences and pro-inflammatory cytokine production that steers adaptive immune responses. Diverse non-viral stimuli, such as lipopolysaccharide and cytokines, also activate NF- κ B and the same anti-pathogen gene networks. Viruses adapted to human cells often encode multiple proteins aimed at varied NF- κ B pathway targeted to mitigate the anti-viral effects of NF- κ B-dependent host immunity. In this study we have demonstrated using numerous assays, in a number of different cell types, that plasmid-encoded or virus-delivered Simian Immunodeficiency Virus (SIV) accessory protein Vpx is a broad antagonist of NF- κ B signalling active against diverse innate NF- κ B agonists. Using targeted Vpx mutagenesis, we showed that this novel Vpx phenotype is independent of known Vpx cofactor DCAF1 and other cellular binding partners, including SAMHD1, STING and the HUSH complex. We found that Vpx co-immunoprecipitated with canonical NF- κ B transcription factor p65 and not NF- κ B transcription factor proteins p50 or p100, preventing nuclear translocation of p65, a novel mechanism of NF- κ B antagonism by lentiviruses. We found that broad antagonism of NF- κ B activation by Vpx was conserved across distantly related lentiviruses as well as for Vpr from SIV Mona monkey (SIVmon), which has Vpx-like SAMHD1-degradation activity. Importance Broad antagonism of NF- κ B activation has been described for HIV-1, but not for Vpx-encoding lentiviruses such as HIV-2. Here we extend our understanding of lentiviral antagonism by identifying an interaction between Vpx and transcription factor NF- κ B p65, leading to inhibition of its nuclear translocation and broad NF- κ B antagonism. This further evidences a requirement for lentiviruses to target universal regulators of immunity, including NF- κ B, to avoid the anti-viral sequelae of pro-inflammatory gene expression stimulated by both viral and extra-viral agonists, such as lipopolysaccharide translocation, during disruption of the gut microbiome barrier during HIV-1 infection. Further structural studies of p65 targeting by Vpx may yield translational insights in the form of novel pan-NF- κ B inhibitors for pathologies characterised by excessive NF- κ B activity. Our findings are also relevant to the gene therapy field where virus-like particle associated Vpx is routinely used to enhance vector transduction through antagonism of SAMHD1, and perhaps also through manipulation of other pathways such as NF- κ B.