Abstract The two principal growth regulators cytokinins and ethylene are known to interact in the regulation of plant growth. However, information about underlying molecular mechanism and positional specificity of the cytokinin/ethylene crosstalk in root growth control is scarce. We have identified spatial specificity of cytokinin-regulated root elongation and root apical meristem (RAM) size, both of which we demonstrate to be ethylene biosynthesis-dependent. Upregulation of the cytokinin biosynthetic gene ISOPENTENYLTRANSFERASE ( IPT ) in proximal and peripheral tissues leads to both root and RAM shortening. In contrast, IPT activation in distal and inner tissues reduces RAM size while leaving the root length comparable to mock-treated controls. We show that cytokinins regulate two steps specific to ethylene biosynthesis, the production of ACC by ACC SYNTHASEs (ACSs), and its conversion to ethylene by ACC OXIDASEs (ACOs). We describe cytokinin- and ethylene-specific regulation controlling the activity of ACSs and ACOs that are spatially discrete along both proximo/distal and radial root axes. Using direct ethylene measurements, we identify ACO2, ACO3 and ACO4 as being responsible for ethylene biosynthesis and the ethylene-regulated root and RAM shortening in cytokinin-treated Arabidopsis . Finally, we describe the tight cooperation between cytokinin and ethylene signaling in cytokinin-induced, ethylene-regulated control of ACO4 due to the direct interaction between ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 2 (ARR2), a member of the multistep phosphorelay cascade and the C-terminal portion of ETHYLENE INSENSITIVE 2 (EIN2-C), a key regulator of canonical ethylene signaling.

ABSTRACT Cytokinin and auxin are plant hormones that coordinate many aspects of plant development. Their interactions in plant underground growth are well established, occurring at the levels of metabolism, signaling, and transport. Unlike many plant hormone classes, cytokinins are represented by more than one active molecule. Multiple mutant lines, blocking specific parts of cytokinin biosynthetic pathways, have enabled research in plants with deficiencies in specific cytokinin-types. While most of these mutants have confirmed the impeding effect of cytokinin on root growth, the ipt29 double mutant instead surprisingly exhibits reduced primary root length compared to wild type. This mutant is impaired in cis -zeatin ( c Z) production, a cytokinin-type that had been considered inactive in the past. Here we have further investigated the intriguing ipt29 root phenotype, opposite to known cytokinin functions, and the (bio)activity of c Z. Our data suggest that despite the ipt29 short-root phenotype, c Z application has a negative impact on primary root growth and can activate a cytokinin response in the stele. Grafting experiments revealed that the root phenotype of ipt29 depends on local signaling which does not relate to directly to cytokinin levels. Notably, ipt29 displayed increased auxin levels in the root tissue. Moreover, analyses of the differential contributions of ipt2 and ipt9 to the ipt29 short-root phenotype demonstrated that, despite its deficiency on c Z levels, ipt2 does not show any root phenotype or auxin homeostasis variation while ipt9 mutants were indistinguishable from ipt29 . We conclude that IPT9 functions may go beyond c Z biosynthesis, directly or indirectly, implicating effects on auxin homeostasis and therefore influencing plant growth.

Two principal growth regulators, cytokinins and ethylene, are known to interact in the regulation of plant growth. However, information about the underlying molecular mechanism and positional specificity of cytokinin/ethylene crosstalk in the control of root growth is scarce. We have identified the spatial specificity of cytokinin-regulated root elongation and root apical meristem (RAM) size, both of which we demonstrate to be dependent on ethylene biosynthesis. Upregulation of the cytokinin biosynthetic gene ISOPENTENYLTRANSFERASE (IPT) in proximal and peripheral tissues leads to both root and RAM shortening. By contrast, IPT activation in distal and inner tissues reduces RAM size while leaving the root length comparable to that of mock-treated controls. We show that cytokinins regulate two steps specific to ethylene biosynthesis: production of the ethylene precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) by ACC SYNTHASEs (ACSs) and its conversion to ethylene by ACC OXIDASEs (ACOs). We describe cytokinin- and ethylene-specific regulation controlling the activity of ACSs and ACOs that are spatially discrete along both proximo/distal and radial root axes. Using direct ethylene measurements, we identify ACO2, ACO3, and ACO4 as being responsible for ethylene biosynthesis and ethylene-regulated root and RAM shortening in cytokinin-treated Arabidopsis. Direct interaction between ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 2 (ARR2), a member of the multistep phosphorelay cascade, and the C-terminal portion of ETHYLENE INSENSITIVE 2 (EIN2-C), a key regulator of canonical ethylene signaling, is involved in the cytokinin-induced, ethylene-mediated control of ACO4. We propose tight cooperation between cytokinin and ethylene signaling in the spatially specific regulation of ethylene biosynthesis as a key aspect of the hormonal control of root growth.

Cytokinins are mobile multifunctional plant hormones with roles in development and stress resilience 1,2. Although cytokinin receptors are substantially localised to the endoplasmic reticulum 3-5, the cellular sites of cytokinin perception continue to be debated 1,6,7. Several cytokinin types display bioactivity 8,9 and recently a cell-specific cytokinin gradient was reported in roots 10. Yet, the importance of spatially heterogeneous cytokinin distribution and the specific cytokinin(s) that account for the different responses remain unclear. Here we show that cytokinin perception by plasma membrane receptors is an effective path for cytokinin response in root cells. Readout from a Two Component Signalling cytokinin-specific reporter (TCSn::GFP; 11) is closely matched to intracellular cytokinin content, yet a proportion of bioactive cytokinins are detected in the extracellular fluid. Using cytokinins covalently linked to beads that could not pass the plasma membrane, we demonstrate that strong TCSn activation still occurs and that this response is greatly diminished in cytokinin receptor mutants. Although intracellular receptors play significant roles, we argue for a revision of concepts of cytokinin perception to include the spatial dimensions. In particular, selective ligand-receptor affinities, cellular localisation and tissue distribution of bioactive cytokinins, their receptors, ransporters and inactivation enzymes appear all to be components of the signalling regulatory mechanisms.

1 Abstract Ribosylated forms of plant hormones cytokinins (CKs) are the dominant CK species translocated at long distances. Their particular roles in plant physiology imply the existence of a yet uncharacterized CK riboside-specific membrane transport system. In this work, we report significant differences in the kinetics of the membrane transport of CK nucleobases and ribosides and the overall affinity of membrane-bound carriers towards the two CK forms. We show that CK ribosides can inhibit the uptake of CK nucleobases in tobacco Bright Yellow 2 cell suspensions but not vice versa, confirming the existence of a membrane transport system that strictly recognizes CK ribosides. We further characterize the membrane transport of CK nucleobases and ribosides mediated by AtENT3 (EQULIBRATIVE NUCLEOSIDE TRANSPORTER 3), showing its preference towards trans -zeatin riboside (tZR) over isopentenyl adenosine (iPR). With the molecular docking and molecular dynamics, we assess the interactions among the side chain of tZR and AtENT3 residues Tyr61 and Asp129, which are conserved in all AtENTs but not in the ENTs from non-plant species. Lastly, we show that atent3 mutation affects shoot phenotype, demonstrating the impact of CK riboside membrane transport on shoot development.

Plant phenotyping represents an increasing promise in plant research by providing a complex picture of plant development and fitness. In research focused on various environmental stresses, phenotyping can uncover markers that can sensitively assess the stress impact in very early stages before morphological changes. PlantScreenTM System represents a tool dedicated for shoot and root phenotyping in soil enabling high-precision, high-throughput phenotyping of small, mid-size and large plants. The system offers wide range of sensors providing the number of non-invasive analyses of morphological and physiological parameters as well as of pigments, water, or metabolite content. In our work, we combined phenotyping approaches to determine morphological changes and the status of the photosynthetic apparatus in Arabidopsis plants exposed to drought stress. Focused on morphology, the rosette area became smaller after seven days of drought stress when compared to control conditions. Interestingly, cytokinin signalling mutant ahk2 ahk3 revealed drought resistance compared to other genotypes. The fluorescent parameters showed higher sensitivity even in wild type. Non-photochemical quenching displayed values connected to reduced activity of photosynthetic apparatus after five days of drought stress. Taken together, acquired fluorescence parameters can serve as a marker of drought stress detection before morphological alterations occur.

Abstract Jasmonates (JAs) are a family of oxylipin phytohormones regulating plant development and growth and mediating ‘defense versus growth’ responses. The upstream JA biosynthetic precursor cis -(+)-12-oxo-phytodienoic acid ( cis -OPDA) has been reported to act independently of the COI1-mediated JA signaling in several stress-induced and developmental processes. However, its means of perception and metabolism are only partially understood. Furthermore, cis -OPDA, but not JA, occurs in non-vascular plant species, such as bryophytes, exhibiting specific functions in defense and development. A few years ago, a low abundant isoleucine analog of the biologically active JA-Ile, OPDA-Ile, was detected in wounded leaves of flowering plants, opening up to the possibility that conjugation of cis -OPDA to amino acids might be a relevant mechanism for cis -OPDA regulation. Here, we extended the analysis of amino acid conjugates of cis -OPDA and identified naturally occurring OPDA-Val, OPDA-Phe, OPDA-Ala, OPDA-Glu, and OPDA-Asp in response to biotic and abiotic stress in Arabidopsis. The newly identified OPDA-amino acid conjugates show cis -OPDA-related plant responses in a JAR1-dependent manner. We also discovered that the synthesis and hydrolysis of cis -OPDA amino acid conjugates are regulated by members of the amidosynthetase GH3 and the amidohydrolase ILR1/ILL families. Finally, we found that the cis -OPDA conjugative pathway already functions in non-vascular plants and gymnosperms. Thus, one level of regulation by which plants modulate cis -OPDA homeostasis is the synthesis and hydrolysis of OPDA-amino acid conjugates, which temporarily store cis -OPDA in stress responses.

The main regions of cell proliferation in plants are the root and shoot apical meristems during primary growth and vascular cambia as lateral meristems during secondary thickening. A number of unique regulators have been described in each of these meristems, suggesting that these different meristems might have independently evolved dedicated transcriptional networks to balance cell proliferation. Here, we show that the basic Helix Loop Helix (bHLH) transcription factor complexes formed by TARGET OF MONOPTEROS5 (TMO5), LONESOME HIGHWAY (LHW) and their close homologs are broadly expressed throughout plant development and operate as general regulators of cell proliferation in all meristems. Yet, genetic and expression analyses indicate that these complexes have specific functions in distinct meristems mediated by heterodimer complex variations between members of TMO5 and LHW subclades. We determine that this is primarily due to their expression domains limiting the possible combinations of heterodimer complexes within a certain meristem, and to a certain extent to the absence of some members in a given meristem. We further demonstrate target gene specificity for heterodimer complexes, suggesting that spatial differences in transcriptional responses through heterodimer diversification allow a common bHLH heterodimer complex module to contribute to the control of cell proliferation in multiple meristems.