Abstract Organophosphorus pesticides (OPs) are a chemically diverse class of commonly used insecticides. Epidemiological studies suggest that low dose chronic prenatal and infant exposures can lead to life-long neurological damage and behavioral disorders. While inhibition of acetylcholinesterase (AChE) is the shared mechanism of acute OP neurotoxicity, OP-induced developmental neurotoxicity (DNT) can occur independently and/or in the absence of significant AChE inhibition, implying that OPs affect alternative targets. Moreover, different OPs can cause different adverse outcomes, suggesting that different OPs act through different mechanisms. These findings emphasize the importance of comparative studies of OP toxicity. Freshwater planarians are an invertebrate system that uniquely allows for automated, rapid and inexpensive testing of adult and developing organisms in parallel to differentiate neurotoxicity from DNT. Effects found only in regenerating planarians would be indicative of DNT, whereas shared effects may represent neurotoxicity. We leverage this unique feature of planarians to investigate potential differential effects of OPs on the adult and developing brain by performing a comparative screen to test 7 OPs (acephate, chlorpyrifos, dichlorvos, diazinon, malathion, parathion and profenofos) across 10 concentrations in quarter-log steps. Neurotoxicity was evaluated using a wide range of quantitative morphological and behavioral readouts. AChE activity was measured using an Ellman assay. The toxicological profiles of the 7 OPs differed across the OPs and between adult and regenerating planarians. Toxicological profiles were not correlated with levels of AChE inhibition. Twenty-two “mechanistic control compounds” known to target pathways suggested in the literature to be affected by OPs (cholinergic neurotransmission, serotonin neurotransmission, endocannabinoid system, cytoskeleton, adenyl cyclase and oxidative stress) and 2 negative controls were also screened. When compared with the mechanistic control compounds, the phenotypic profiles of the different OPs separated into distinct clusters. The phenotypic profiles of adult vs regenerating planarians exposed to the OPs clustered differently, suggesting some developmental-specific mechanisms. These results further support findings in other systems that OPs cause different adverse outcomes in the (developing) brain and build the foundation for future comparative studies focused on delineating the mechanisms of OP neurotoxicity in planarians.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are abundant in sepsis, and proposed NET-directed therapies in sepsis prevent their formation or accelerate degradation. Yet NETs are important for microbial entrapment, as NET digestion liberates pathogens and NET degradation products (NDPs) that deleteriously promote thrombosis and endothelial cell injury. We proposed an alternative strategy of NET-stabilization with the chemokine, platelet factor 4 (PF4, CXCL4), which we have shown enhances NET-mediated microbial entrapment. We now show that NET compaction by PF4 reduces their thrombogenicity. In vitro, we quantified plasma thrombin and fibrin generation by intact or degraded NETs and cell-free (cf) DNA fragments, and found that digested NETs and short DNA fragments were more thrombogenic than intact NETs and high molecular weight genomic DNA, respectively. PF4 reduced the thrombogenicity of digested NETs and DNA by interfering, in part, with contact pathway activation. In endothelial cell culture studies, short DNA fragments promoted von Willebrand factor release and tissue factor expression via a toll-like receptor 9-dependent mechanism. PF4 blocked these effects. Cxcl4-/- mice infused with cfDNA exhibited higher plasma thrombin anti-thrombin (TAT) levels compared to wild-type controls. Following challenge with bacterial lipopolysaccharide, Cxcl4-/- mice had similar elevations in plasma TAT and cfDNA, effects prevented by PF4 infusion. Thus, NET-stabilization by PF4 prevents the release of short fragments of cfDNA, limiting the activation of the contact coagulation pathway and reducing endothelial injury. These results support our hypothesis that NET-stabilization reduces pathologic sequelae in sepsis, an observation of potential clinical benefit.

-Thalassemia (AT) is one of the most commonly occurring inherited hematological diseases. However, few treatments are available, and allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is the only available therapeutic option for patients with severe AT. Research into AT has remained limited due to a lack of adult mouse models, with severe AT typically resulting in in utero lethality. By using a lipid nanoparticle (LNP) targeting the receptor CD117 and delivering a Cre mRNA (mRNACreLNPCD117), we were able to delete floxed -globin genes at high efficiency in hematopoietic stem cells (HSC) ex vivo. These cells were then engrafted in the absence or presence of a novel α-globin expressing lentiviral vector (ALS20I). Myeloablated mice transplanted with mRNACreLNPCD117-treated HSC showed a complete knockout of -globin genes. They demonstrated a phenotype characterized by the synthesis of hemoglobin H (-tetramers,  or HbH), aberrant erythropoiesis, and abnormal organ morphology, culminating in lethality approximately eight weeks following engraftment. Mice receiving mRNACreLNPCD117-treated HSC with at least one copy of ALS20I survived long-term with normalization of erythropoiesis, decreased the production of HbH, and ameliorated the abnormal organ morphology. Furthermore, we tested ALS20I in erythroid progenitors derived from -globin-KO CD34+ and cells isolated from patients with both deletional and non-deletional HbH disease, demonstrating improvement in -globin/-globin mRNA ratio and reduction in the formation of HbH by HPLC. Our results demonstrate the broad applicability of LNP for disease modeling, characterization of a novel severe mouse model of AT, and the efficacy of ALS20I for treating AT.

High-throughput screening (HTS) using new approach methods is revolutionizing toxicology. Asexual freshwater planarians are a promising invertebrate model for neurotoxicity HTS because their diverse behaviors can be used as quantitative readouts of neuronal function. Currently, three planarian species are commonly used in toxicology research: Dugesia japonica, Schmidtea mediterranea, and Girardia tigrina. However, only D. japonica has been demonstrated to be suitable for HTS. Here, we assess the two other species for HTS suitability by direct comparison with D. japonica. Through quantitative assessments of morphology and multiple behaviors, we assayed the effects of 4 common solvents (DMSO, ethanol, methanol, ethyl acetate) and a negative control (sorbitol) on neurodevelopment. Each chemical was screened blind at 5 concentrations at two time points over a twelve-day period. We obtained two main results: First, G. tigrina and S. mediterranea planarians showed significantly reduced movement compared to D. japonica under HTS conditions, due to decreased health over time and lack of movement under red lighting, respectively. This made it difficult to obtain meaningful readouts from these species. Second, we observed species differences in sensitivity to the solvents, suggesting that care must be taken when extrapolating chemical effects across planarian species. Overall, our data show that D. japonica is best suited for behavioral HTS given the limitations of the other species. Standardizing which planarian species is used in neurotoxicity screening will facilitate data comparisons across research groups and accelerate the application of this promising invertebrate system for first-tier chemical HTS, helping streamline toxicology testing.