Abstract Unculturable bacterial communities provide a rich source of biocatalysts, but their experimental discovery by functional metagenomics is difficult, because the odds are stacked against the experimentor. Here we demonstrate functional screening of a million-membered metagenomic library in microfluidic picolitre droplet compartments. Using bait substrates, new hydrolases for sulfate monoesters and phosphotriesters were identified, mostly based on promiscuous activities presumed not to be under selection pressure. Spanning three protein superfamilies, these break new ground in sequence space: promiscuity now connects enzymes with only distantly related sequences. Most hits could not have been predicted by sequence analysis, because the desired activities have never been ascribed to similar sequences, showing how this approach complements bioinformatic harvesting of metagenomic sequencing data. Functional screening of a library of unprecedented size with excellent assay sensitivity has been instrumental in identifying rare genes constituting catalytically versatile hubs in sequence space as potential starting points for the acquisition of new functions.

A divergent synthetic strategy for generating helical p53 peptides bearing functionalised staple linkages, allowing for efficient optimisation of cellular activity.

Abstract Exchanges of protein sequence modules support leaps in function unavailable through point mutations during evolution. Here we study the role of the two RAD51-interacting modules within the eight binding BRC repeats of BRCA2. We created 64 chimeric repeats by shuffling these modules and measured their binding to RAD51. We found that certain shuffled repeats were stronger than any of the natural repeats, suggesting balancing of relative properties in BRC repeats. Surprisingly, the contribution from the two modules was poorly correlated with affinities of natural repeats, with weak BRC8 repeat containing the most effective N-terminal module. The binding of the strongest chimera, BRC8-2, to RAD51 was improved by −2.44 kCal/mol compared to the strongest natural repeat, BRC4. Crystal structure of RAD51:BRC8-2 complex shows an improved interface fit and an extended β-hairpin in this repeat. BRC8-2 was shown to function in human cells, preventing the formation of nuclear foci after ionizing radiation.

Abstract The TGFβ superfamily of secreted growth factors comprises more than 30 members including TGFβs, BMPs and Activins. While all TGFβ superfamily members signal through heteromeric receptor complexes to regulate a plethora of developmental and homeostatic processes, each ligand possesses a unique affinity towards a subset of BMP and TGFβ type I and type II receptors. Whereas the Activin and TGFβ class display a higher affinity towards type II receptors, BMPs and GDFs preferentially bind to type I receptors. Sofar, the lack of specific antibodies and chemical biology tools hampered simultaneous testing of ligand binding towards all BMP and TGFβ receptors. Here we present a N-terminally Halo- and SNAP-tagged TGFβ/BMP receptor library to visualize the receptor complexes in dual color. In combination with novel fluorescently labeled TGFβ superfamily ligands, we established a Ligand Surface Binding Assay (LSBA) for optical quantification of receptor-dependent growth factor binding for Activin A, TGFβ1 and BMP9 in a cellular context. We confirm ligand-receptor interface specificity by identifying BMPR2- or ALK2-mutants that switch from a low-affinity Activin A- or BMP9-receptor to a high-affinity receptor, respectively.

Abstract Monoclonal antibodies are increasingly used to prevent and treat viral infections, playing a pivotal role in pandemic response efforts. Antibody secreting cells (ASCs, plasma cells and plasmablasts) are an excellent source of high-affinity antibodies with therapeutic potential. Current methodologies to study antigen-specific ASCs either have low throughput, require expensive and labour-intensive screening or are technically demanding and therefore not accessible to the wider research community. Here, we present a straightforward technology for the rapid discovery of monoclonal antibodies from ASCs: we combine microfluidic encapsulation of single cells into an antibody capture hydrogel with antigen bait sorting by conventional flow cytometry. With our technology, we screened millions of mouse and human ASCs and obtained anti-SARS-CoV-2 monoclonal antibodies with high affinity (pM) and neutralising capacity (<100 ng/mL) in two weeks with a high hit rate (>85%). By facilitating access into the underexplored ASC compartment, we enable fast and efficient antibody discovery as well as immunological studies into the generation of protective antibodies.

Abstract Tandem-repeat proteins comprise small secondary structure motifs that stack to form one-dimensional arrays with distinctive mechanical properties that are proposed to direct their cellular functions. Here, we use single-molecule optical tweezers to study the folding of consensus-designed tetratricopeptide repeats (CTPRs) — superhelical arrays of short helix-turn-helix motifs. We find that CTPRs display a spring-like mechanical response in which individual repeats undergo rapid equilibrium fluctuations between folded and unfolded conformations. We rationalise the force response using Ising models and dissect the folding pathway of CTPRs under mechanical load, revealing how the repeat arrays form from the centre towards both termini simultaneously. Strikingly, we also directly observe the protein’s superhelical tertiary structure in the force signal. Using protein engineering, crystallography and single-molecule experiments, we show how the superhelical geometry can be altered by carefully placed amino-acid substitutions and examine how these sequence changes affect intrinsic repeat stability and inter-repeat coupling. Our findings provide the means to dissect and modulate repeat-protein stability and dynamics, which will be essential for researchers to understand the function of natural repeat proteins and to exploit artificial repeats proteins in nanotechnology and biomedical applications. Significance statement Repetition of biological building blocks is crucial to modulating and diversifying structure and function of biomolecules across all organisms. In tandem-repeat proteins, the linear arrangement of small structural motifs leads to the formation of striking supramolecular shapes. Using a combination of single-molecule biophysical techniques and modelling approaches, we dissect the spring-like nature of a designed repeat protein and demonstrate how its shape and mechanics can be manipulated by design. These novel insights into the biomechanical and biochemical characteristics of this protein class give us a methodological basis from which to understand the biological functions of repeat proteins and to exploit them in nanotechnology and biomedicine.

Summary The induction of interferon-stimulated genes by signal transducer and activator of transcription (STAT) proteins, is a critical host defence to fight virus infections. Here, a highly expressed poxvirus protein 018 is shown to inhibit IFN-induced signalling by binding the SH2 domain of STAT1 to prevent STAT1 association with an activated IFN receptor. Despite the presence of additional inhibitors of IFN-induced signalling, a poxvirus lacking 018 was attenuated in mice. The 2.0 Å crystal structure of the 018:STAT1 complex reveals a mechanism for a high-affinity, pTyr-independent mode of binding to an SH2 domain. Furthermore, the STAT1 binding motif of 018 shows sequence similarity to the STAT1-binding proteins from Nipah virus, which like 018, block the association of STAT1 with an IFN receptor. Taken together, these results provide detailed mechanistic insight into a potent mode of STAT1 antagonism, found to exist in genetically diverse virus families.

Abstract CK2α is a ubiquitous, well-studied protein kinase that is a target for small molecule inhibition, for treatment of cancers. While many different classes of ATP-competitive inhibitors have been described for CK2α, they tend to suffer from significant off-target activity and new approaches are needed. A series of inhibitors of CK2α has recently been described as allosteric, acting at a previously unidentified binding site. Given the similarity of these inhibitors to known ATP-competitive inhibitors, we have investigated these further. In our thorough structural and biophysical analyses, we have found no evidence that these inhibitors bind to the proposed allosteric site. Rather, we report crystal structures, competitive ITC and NMR, HDX mass spectrometry and chemoinformatic analyses that all point to these compounds binding in the ATP pocket. Our crystal structures however do show that the proposed allosteric site can bind ligands, just not those in the previously described series. Comparison of our results and experimental details with the data presented in the original report suggest several reasons for the disparity in our conclusions, the primary reason being non-specific inhibition by aggregation. Table of Content graphics

SUMMARY BRCA2 controls RAD51 recombinase during homologous DNA recombination (HDR) through eight evolutionarily-conserved BRC repeats, which individually engage RAD51 via the motif Phe-x-x-Ala. Using structure-guided molecular design, templated on a monomeric thermostable chimera between human RAD51 and archaeal RadA, we identify CAM833, a 529 Da orthosteric inhibitor of RAD51:BRC with a K d of 366 nM. The quinoline of CAM833 occupies a hotspot, the Phe-binding pocket on RAD51 and the methyl of the substituted α-methylbenzyl group occupies the Ala-binding pocket. In cells, CAM833 diminishes formation of damage-induced RAD51 nuclear foci; inhibits RAD51 molecular clustering, suppressing extended RAD51 filament assembly; potentiates cytotoxicity by ionising radiation, augmenting 4N cell-cycle arrest and apoptotic cell death and works with poly-ADP ribose polymerase (PARP)1 inhibitors to suppress growth in BRCA2-wildtype cells. Thus, chemical inhibition of the protein-protein interaction between BRCA2 and RAD51 disrupts HDR and potentiates DNA damage-induced cell death, with implications for cancer therapy.