Aging CellVolume 14, Issue 4 p. 644-658 Original ArticleOpen Access The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs Yi Zhu, Yi Zhu Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USACo-first authors.Search for more papers by this authorTamara Tchkonia, Tamara Tchkonia Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USACo-first authors.Search for more papers by this authorTamar Pirtskhalava, Tamar Pirtskhalava Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorAdam C. Gower, Adam C. Gower Section of Computational Biomedicine, Boston University School of Medicine, Boston, MA, USASearch for more papers by this authorHusheng Ding, Husheng Ding Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorNino Giorgadze, Nino Giorgadze Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorAllyson K. Palmer, Allyson K. Palmer Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorYuji Ikeno, Yuji Ikeno Departments of Pathology, Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, The University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX, USA Research Service, Geriatric Research and Education Clinical Center, Audie L. Murphy VA Hospital South Texas Veterans Health Care System, San Antonio, TX, USASearch for more papers by this authorGene B. Hubbard, Gene B. Hubbard Departments of Pathology, Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, The University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX, USA Research Service, Geriatric Research and Education Clinical Center, Audie L. Murphy VA Hospital South Texas Veterans Health Care System, San Antonio, TX, USASearch for more papers by this authorMarc Lenburg, Marc Lenburg Section of Computational Biomedicine, Boston University School of Medicine, Boston, MA, USASearch for more papers by this authorSteven P. O'Hara, Steven P. O'Hara Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorNicholas F. LaRusso, Nicholas F. LaRusso Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorJordan D. Miller, Jordan D. Miller Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorCarolyn M. Roos, Carolyn M. Roos Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorGrace C. Verzosa, Grace C. Verzosa Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorNathan K. LeBrasseur, Nathan K. LeBrasseur Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorJonathan D. Wren, Jonathan D. Wren Department of Biochemistry and Molecular Biology, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK, USASearch for more papers by this authorJoshua N. Farr, Joshua N. Farr Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorSundeep Khosla, Sundeep Khosla Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorMichael B. Stout, Michael B. Stout Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorSara J. McGowan, Sara J. McGowan Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorHeike Fuhrmann-Stroissnigg, Heike Fuhrmann-Stroissnigg Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorAditi U. Gurkar, Aditi U. Gurkar Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorJing Zhao, Jing Zhao Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorDebora Colangelo, Debora Colangelo Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorAkaitz Dorronsoro, Akaitz Dorronsoro Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorYuan Yuan Ling, Yuan Yuan Ling Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorAmira S. Barghouthy, Amira S. Barghouthy Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorDiana C. Navarro, Diana C. Navarro Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorTokio Sano, Tokio Sano Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorPaul D. Robbins, Paul D. Robbins Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorLaura J. Niedernhofer, Laura J. Niedernhofer Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorJames L. Kirkland, Corresponding Author James L. Kirkland Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA Correspondence James L. Kirkland, Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, 200 First Street, S.W., Rochester, MN 55905, USA. Tel.: +1 507 266 9151; fax: +1 507 293 3853; e-mail:Kirkland.james@mayo.eduSearch for more papers by this author Yi Zhu, Yi Zhu Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USACo-first authors.Search for more papers by this authorTamara Tchkonia, Tamara Tchkonia Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USACo-first authors.Search for more papers by this authorTamar Pirtskhalava, Tamar Pirtskhalava Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorAdam C. Gower, Adam C. Gower Section of Computational Biomedicine, Boston University School of Medicine, Boston, MA, USASearch for more papers by this authorHusheng Ding, Husheng Ding Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorNino Giorgadze, Nino Giorgadze Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorAllyson K. Palmer, Allyson K. Palmer Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorYuji Ikeno, Yuji Ikeno Departments of Pathology, Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, The University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX, USA Research Service, Geriatric Research and Education Clinical Center, Audie L. Murphy VA Hospital South Texas Veterans Health Care System, San Antonio, TX, USASearch for more papers by this authorGene B. Hubbard, Gene B. Hubbard Departments of Pathology, Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, The University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX, USA Research Service, Geriatric Research and Education Clinical Center, Audie L. Murphy VA Hospital South Texas Veterans Health Care System, San Antonio, TX, USASearch for more papers by this authorMarc Lenburg, Marc Lenburg Section of Computational Biomedicine, Boston University School of Medicine, Boston, MA, USASearch for more papers by this authorSteven P. O'Hara, Steven P. O'Hara Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorNicholas F. LaRusso, Nicholas F. LaRusso Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorJordan D. Miller, Jordan D. Miller Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorCarolyn M. Roos, Carolyn M. Roos Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorGrace C. Verzosa, Grace C. Verzosa Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorNathan K. LeBrasseur, Nathan K. LeBrasseur Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorJonathan D. Wren, Jonathan D. Wren Department of Biochemistry and Molecular Biology, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK, USASearch for more papers by this authorJoshua N. Farr, Joshua N. Farr Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorSundeep Khosla, Sundeep Khosla Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorMichael B. Stout, Michael B. Stout Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USASearch for more papers by this authorSara J. McGowan, Sara J. McGowan Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorHeike Fuhrmann-Stroissnigg, Heike Fuhrmann-Stroissnigg Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorAditi U. Gurkar, Aditi U. Gurkar Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorJing Zhao, Jing Zhao Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorDebora Colangelo, Debora Colangelo Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorAkaitz Dorronsoro, Akaitz Dorronsoro Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorYuan Yuan Ling, Yuan Yuan Ling Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorAmira S. Barghouthy, Amira S. Barghouthy Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorDiana C. Navarro, Diana C. Navarro Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorTokio Sano, Tokio Sano Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorPaul D. Robbins, Paul D. Robbins Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorLaura J. Niedernhofer, Laura J. Niedernhofer Department of Metabolism and Aging, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL, USASearch for more papers by this authorJames L. Kirkland, Corresponding Author James L. Kirkland Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA Correspondence James L. Kirkland, Robert and Arlene Kogod Center on Aging, Mayo Clinic, 200 First Street, S.W., Rochester, MN 55905, USA. Tel.: +1 507 266 9151; fax: +1 507 293 3853; e-mail:Kirkland.james@mayo.eduSearch for more papers by this author First published: 09 March 2015 https://doi.org/10.1111/acel.12344Citations: 1,149 AboutSectionsPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onFacebookTwitterLinkedInRedditWechat Summary The healthspan of mice is enhanced by killing senescent cells using a transgenic suicide gene. Achieving the same using small molecules would have a tremendous impact on quality of life and the burden of age-related chronic diseases. Here, we describe the rationale for identification and validation of a new class of drugs termed senolytics, which selectively kill senescent cells. By transcript analysis, we discovered increased expression of pro-survival networks in senescent cells, consistent with their established resistance to apoptosis. Using siRNA to silence expression of key nodes of this network, including ephrins (EFNB1 or 3), PI3Kδ, p21, BCL-xL, or plasminogen-activated inhibitor-2, killed senescent cells, but not proliferating or quiescent, differentiated cells. Drugs targeting these same factors selectively killed senescent cells. Dasatinib eliminated senescent human fat cell progenitors, while quercetin was more effective against senescent human endothelial cells and mouse BM-MSCs. The combination of dasatinib and quercetin was effective in eliminating senescent MEFs. In vivo, this combination reduced senescent cell burden in chronologically aged, radiation-exposed, and progeroid Ercc1−/Δ mice. In old mice, cardiac function and carotid vascular reactivity were improved 5 days after a single dose. Following irradiation of one limb in mice, a single dose led to improved exercise capacity for at least 7 months following drug treatment. Periodic drug administration extended healthspan in Ercc1−/∆ mice, delaying age-related symptoms and pathology, osteoporosis, and loss of intervertebral disk proteoglycans. These results demonstrate the feasibility of selectively ablating senescent cells and the efficacy of senolytics for alleviating symptoms of frailty and extending healthspan. Introduction Aging is the leading risk factor for the chronic diseases that account for the bulk of morbidity, mortality, and health costs (Goldman et al., 2013). A fundamental aging mechanism that likely contributes to chronic diseases and age-related dysfunction is cellular senescence (Kirkland, 2013b,a; Tchkonia et al., 2013; Kirkland & Tchkonia, 2014). Senescence refers to the essentially irreversible growth arrest that occurs when cells are subjected to potentially oncogenic insults (Tchkonia et al., 2013). Even though senescent cell abundance in aging or diseased tissues is low, achieving a maximum of 15 percent of nucleated cells in very old primates, senescent cells can secrete pro-inflammatory cytokines, chemokines, and extracellular matrix proteases, which together constitute the senescence-associated secretory phenotype or SASP (Herbig et al., 2006; Coppé et al., 2008; Kuilman et al., 2008). The SASP likely contributes to the correlation between senescent cell accumulation and local and systemic dysfunction and disease. Consistent with a role for cellular senescence in causing age-related dysfunction, clearing senescent cells by activating a drug-inducible ‘suicide’ gene enhances healthspan and delays multiple age-related phenotypes in genetically modified progeroid mice (Baker et al., 2011). Interestingly, despite only clearing 30 percent of the senescent cells, improvement in age-related phenotypes is profound. Thus, interventions that reduce the burden of senescent cells could ameliorate age-related disabilities and chronic diseases as a group (Tchkonia et al., 2013; Kirkland & Tchkonia, 2014). Despite their harsh internal and external microenvironments, senescent cells are viable. They survive even though they have active DNA damage responses, heightened metabolic flux, and increased local levels of SASP inflammatory cytokines and other factors that are able to induce apoptosis. Indeed, senescent cells are better able to withstand stresses such as serum deprivation than nonsenescent cells (Wang, 1995; Fridman & Lowe, 2003). In vivo, senescent cells appear to be removed by the immune system (Xue et al., 2007), rather than apoptosis or necrosis. Therefore, we hypothesized that (i) anti-apoptotic, pro-survival mechanisms could be up-regulated in senescent cells and (ii) interfering with these protective mechanisms might achieve selective elimination of senescent cells. Based on these hypotheses, here we identified several clinically used drugs that induce apoptosis preferentially of senescent cells in vitro and in vivo, leading to improved cardiovascular function and exercise endurance, reduced osteoporosis and frailty, and extended healthspan in several murine systems. Results The senescent transcriptome and anti-apoptotic pathways We first tested our hypotheses by comparing gene expression in senescent vs. nonsenescent cells using transcript array analysis (Fig. 1A–C). We focused on fat cell progenitors, or preadipocytes, as they are arguably one of the most abundant types of senescent cells in humans (Tchkonia et al., 2010). Cultures were split and senescence induced in half of the cells using 10 Gy of ionizing radiation. Twenty-five days later, gene expression was measured using Affymetrix arrays and differential expression patterns identified by principal component analysis (see Supporting materials and methods Data S1 for details). Overall patterns of gene expression differed substantially between senescent and nonsenescent preadipocytes isolated from the same subjects (Fig. 1A). Analyses of gene categories indeed revealed up-regulation of negative regulators of apoptosis (Fig. 1B) and anti-apoptotic gene sets (Fig. 1C) in senescent compared to nonsenescent cells (see also Supporting information Fig. S8). Figure 1Open in figure viewerPowerPoint Senescent cells can be selectively targeted by suppressing pro-survival mechanisms. (A) Principal components analysis of detected features in senescent (green squares) vs. nonsenescent (red squares) human abdominal subcutaneous preadipocytes indicating major differences between senescent and nonsenescent preadipocytes in overall gene expression. Senescence had been induced by exposure to 10 Gy radiation (vs. sham radiation) 25 days before RNA isolation. Each square represents one subject (cell donor). (B, C) Anti-apoptotic, pro-survival pathways are up-regulated in senescent vs. nonsenescent cells. Heat maps of the leading edges of gene sets related to anti-apoptotic function, ‘negative regulation of apoptosis’ (B) and ‘anti-apoptosis’ (C), in senescent vs. nonsenescent preadipocytes are shown (red = higher; blue = lower). Each column represents one subject. Samples are ordered from left to right by proliferative state (N = 8). The rows represent expression of a single gene and are ordered from top to bottom by the absolute value of the Student t statistic computed between the senescent and proliferating cells (i.e., from greatest to least significance, see also Fig. S8). (D–E) Targeting survival pathways by siRNA reduces viability (ATPLite) of radiation-induced senescent human abdominal subcutaneous primary preadipocytes (D) and HUVECs (E) to a greater extent than nonsenescent sham-radiated proliferating cells. siRNA transduced on day 0 against ephrin ligand B1 (EFNB1), EFNB3, phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase delta catalytic subunit (PI3KCD), cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21), and plasminogen-activated inhibitor-2 (PAI-2) messages induced significant decreases in ATPLite-reactive senescent (solid bars) vs. proliferating (open bars) cells by day 4 (100, denoted by the red line, is control, scrambled siRNA). N = 6; *P < 0.05; t-tests. (F–G) Decreased survival (crystal violet stain intensity) in response to siRNAs in senescent vs. nonsenescent preadipocytes (F) and HUVECs (G). N = 5; *P < 0.05; t-tests. (H) Network analysis to test links among EFNB-1, EFNB-3, PI3KCD, p21 (CDKN1A), PAI-1 (SERPINE1), PAI-2 (SERPINB2), BCL-xL, and MCL-1. Senolytic siRNAs We next employed RNA interference to identify potential ‘senolytic’ targets. We used the following rationale for the selection of senescence-associated genes to target with siRNAs. (i) Senescent cells rely on anti-apoptotic, pro-survival defenses to a greater extent than nonsenescent cells. (ii) Senescent cells have much in common with cancer cells, such as active DNA damage responses (Ghosal & Chen, 2013), except senescent cells do not divide. Thus pro-survival pathways, which when inhibited drive cancer cell apoptosis, might be good targets as long as the pathway is not linked to cell proliferation. (iii) Similarly to cancer cells, senescent cells are metabolically active, with increased glycolysis (Dorr et al., 2013). Thus, senescent cells may be more dependent on pathways that protect against metabolically induced apoptosis than are nonsenescent cells. (iv) Dependence receptors promote apoptosis unless they are prevented from doing so by the presence of their ligands (Goldschneider & Mehlen, 2010). Thus, senescent cells may rely more on dependence receptor ligands than nonsenescent cells, as is the case in cancer cells (Goldschneider & Mehlen, 2010; Xi et al., 2012). Therefore, we targeted anti-apoptotic pathway elements by RNA interference, including the dependence receptor ligands and metabolic pro-survival transcripts identified in oncology. Importantly, targets identified by this rationale have the potential to yield senolytics that also will have antitumor effects. Of the 39 transcripts selected for knockdown by siRNA transfection, at least 17 affected the viability of senescent cells more than the viability of nonsenescent cells (Supporting information Table S1). Of these, six triggered senescent cell death, but had little effect on proliferating, nonsenescent cells in two human cell types, preadipocytes (Fig. 1D,F) and endothelial cells (Fig. 1E,G). Interestingly, the senolytic transcripts included components of ephrin survival-regulating dependence receptor mechanisms (Goldschneider & Mehlen, 2010), ephrin ligand (EFN) B1, and EFNB3, as well as the cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21), plasminogen-activated inhibitor-2 (PAI-2), the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase delta catalytic subunit (PI3KCD), a PI3K family member involved in regulating multiple cellular functions, including survival (Datta et al., 1999; Osaki et al., 2004), and BCL-xL, which regulates mitochondrial-dependent apoptosis and is the target of certain anticancer drugs (Minn et al., 1999; Leech et al., 2000). Interfering with expression of EFNB1 or 3, PI3KCD, p21, BCL-xL, or PAI-2 significantly reduced the viability (ATPLite intensity; Fig. 1D) and survival (crystal violet; Fig. 1F and Fig. S6) of senescent but not proliferating human abdominal subcutaneous preadipocytes. Reducing EFNB2 or 4 or PI3K isoforms other than PI3KCD had less or no effect (Fig. S2C; Table S1). siRNA transfection efficiencies and extent of mRNA knockdown were similar in senescent and proliferating preadipocytes (Fig. S1). Results were confirmed using second, distinct siRNAs or by Western immunoanalysis (Fig. S2A, B, & F). While proliferating human umbilical vein cells (HUVECs) tended to be generally susceptible to siRNAs under the conditions used, senescent HUVECs were more susceptible to EFNB1 and BCL-xL siRNAs than nonsenescent cells (Fig. 1E,G). EFNB1 or 3 and PI3KCD siRNAs also interfered with the viability of preadipocytes made senescent by serial subculturing compared to nonsenescent cells (Fig. S2D) and did not interfere with the viability of quiescent, differentiated preadipocytes (Fig. S2E). Results were confirmed using crystal violet to measure cell survival (Fig. 1G; Fig. S6). Based on potential associations among the genes targeted by senolytic siRNAs, we tested whether the gene products could be components of a common pro-survival signaling network (Fig. 1H). Network analysis of these proteins using the STRING database suggested interaction of the anti-apoptotic proteins that we identified in siRNA assays. Candidate senolytic drugs in vitro We next tested whether drugs that target gene products that protect senescent cells from apoptosis are senolytic in vitro. Of 46 agents tested, dasatinib (D) and quercetin (Q) showed particular promise in clearing senescent cells. D is a inhibitor of multiple tyrosine kinases, used for treating cancers (Montero et al., 2011), and is known to interfere with EFNB-dependent supprepression of apoptosis (Chang et al., 2008; Xi et al., 2012). D preferentially reduced viability and caused cell death of senescent human preadipocytes, but was much less effective on senescent HUVECs (Fig. 2A). Note that by day 3, proliferating preadipocytes increased by 2-5-fold in number vs. day 0 in the presence of D. The viability of nondividing, senescent preadipocytes from the same subjects decreased by 30–40% in the presence of 50 nm or greater D, indicating selective reduction in the viability of senescent cells. Q, a natural flavonol, inhibits PI3K, other kinases, and serpines (Olave et al., 2010; Bruning, 2013). In contrast to D, at low concentrations, Q reduced the viability and caused cell death of senescent HUVECs to a greater extent than proliferating cells, but was less effective on preadipocytes (Fig. 2B). Note that at 10 μm Q, nonsenescent HUVECs achieved a 2-3-fold increase in cell number between days 0 and 3, while parallel cultures of senescent cells were reduced by 50%, indicating selective killing of senescent cells. The combination of D+Q afforded selective killing of both senescent preadipocytes and endothelial cells (Fig. 2C-F). By day 3, the viability of nondividing senescent preadipocytes exposed to D+Q was reduced by ~70% compared to day 0, while nonsenescent, proliferating cells had increased by 2 - 4-fold. By day 3, the viability of senescent HUVECs treated with 10 μm Q and 100 nm D was reduced by ~50% compared to day 0. Parallel cultures of nonsenescent, proliferating HUVECs increased in number by 1.5-fold over the same period of time. This suggests that the combination of D+Q selectively targets a broader range of senescent cell types than either agent alone. In both senescent and nonsenescent cultured preadipocytes, D and Q reduced expression of the anti-apoptotic regulator PAI-2 (Fig. 2G,H). Figure 2Open in figure viewerPowerPoint Dasatinib and quercetin target senescent cells. (A) D is more effective in selectively reducing viability (ATPLite) of senescent preadipocytes than HUVECs. Preadipocytes and HUVECs were exposed to different concentrations of D for 3 days. The red line denotes plating densities on day 0 of nondividing senescent (set to 100%) as well as proliferating nonsenescent cells (also set to 100%). Preadipocyte data are means ± SEM of four experiments in each of four different subjects. HUVEC data are means ± SEM of five replicates at each concentration. (B) Q is more effective in selectively reducing viability (ATPLite) of senescent HUVECs than preadipocytes. Proliferating and senescent preadipocytes and HUVECs were exposed to different concentrations of Q for 3 days. Preadipocyte data are means ± SEM of four experiments in each of four different subjects. HUVEC data are means ± SEM of five replicates at each concentration. (C) Combining D and Q selectively reduced viability of both senescent preadipocytes and senescent HUVECs. Proliferating and senescent preadipocytes and HUVECs were exposed to a fixed concentration of Q and different concentrations of D for 3 days. Optimal Q concentrations for inducing death of senescent preadipocyte and HUVEC cells were 20 and 10 μm, respectively. (D) D and Q do not affect the viability of quiescent fat cells. Nonsenescent preadipocytes (proliferating) as well as nonproliferating, nonsenescent differentiated fat cells prepared from preadipocytes (differentiated), as well as nonproliferating preadipocytes that had been exposed to 10 Gy radiation 25 days before to induce senescence (senescent) were treated with D+Q for 48 h. N = 6 preadipocyte cultures isolated from different subjects. *P < 0.05; anova. 100% indicates ATPLite intensity at day 0 for each cell type and the bars represent the ATPLite intensity after 72 h. The drugs resulted in lower ATPLite in proliferating cells than in vehicle-treated cells after 72 h, but ATPLite intensity did not fall below that at day 0. This is consistent with inhibition of proliferation, and not necessarily cell death. Fat cell ATPLite was not substantially affected by the drugs, consistent with lack of an effect of even high doses of D+Q on nonproliferating, differentiated cells. ATPLite was lower in senescent cells exposed to the drugs for 72 h than at plating on day 0. As senescent cells do not proliferate, this indicates that the drugs decrease senescent cell viability. (E, F) D and Q cause more apoptosis of senescent than nonsenescent primary human preadipocytes (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling [TUNEL] assay). (E) D (200 nM) plus Q (20 μm) resulted in 65% apoptotic cells (TUNEL assay) after 12 h in senescent but not proliferating, nonsenescent preadipocyte cultures. Cells were from three subjects; four replicates; **P < 0.0001; anova. (F) Primary human preadipocytes were stained with DAPI to show nuclei or analyzed by TUNEL to show apoptotic cells. Senescence was induced by 10 Gy radiation 25 days previously. Proliferating, nonsenescent cells were exposed to D+Q for 24 h, and senescent cells from the same subjects were exposed to vehicle or D+Q. D+Q induced apoptosis in senescent, but not nonsenescent, cells (compare the green in the upper to lower right panels). The bars indicate 50 μm. (G) Effect of vehicle, D, Q, or D+Q on nonsenescent preadipocyte and HUVEC p21, BCL-xL, and PAI-2 by Western immunoanalysis. (H) Effect of vehicle, D, Q, or D+Q on preadipocyte on PAI-2 mRNA by PCR. N = 3; *P < 0.05; anova. Dasatinib and que

Physical function declines in old age, portending disability, increased health expenditures, and mortality. Cellular senescence, leading to tissue dysfunction, may contribute to these consequences of aging, but whether senescence can directly drive age-related pathology and be therapeutically targeted is still unclear. Here we demonstrate that transplanting relatively small numbers of senescent cells into young mice is sufficient to cause persistent physical dysfunction, as well as to spread cellular senescence to host tissues. Transplanting even fewer senescent cells had the same effect in older recipients and was accompanied by reduced survival, indicating the potency of senescent cells in shortening health- and lifespan. The senolytic cocktail, dasatinib plus quercetin, which causes selective elimination of senescent cells, decreased the number of naturally occurring senescent cells and their secretion of frailty-related proinflammatory cytokines in explants of human adipose tissue. Moreover, intermittent oral administration of senolytics to both senescent cell–transplanted young mice and naturally aged mice alleviated physical dysfunction and increased post-treatment survival by 36% while reducing mortality hazard to 65%. Our study provides proof-of-concept evidence that senescent cells can cause physical dysfunction and decreased survival even in young mice, while senolytics can enhance remaining health- and lifespan in old mice. Transfer of senescent cells into naive, young mice can induce physical dysfunction, and a senolytic can reverse this dysfunction and potently increase lifespan in aged mice.

Genetic or pharmacological depletion of senescent cells or inhibition of their function reduces bone loss in aged mice. Aging is associated with increased cellular senescence, which is hypothesized to drive the eventual development of multiple comorbidities1. Here we investigate a role for senescent cells in age-related bone loss through multiple approaches. In particular, we used either genetic (i.e., the INK-ATTAC 'suicide' transgene encoding an inducible caspase 8 expressed specifically in senescent cells2,3,4) or pharmacological (i.e., 'senolytic' compounds5,6) means to eliminate senescent cells. We also inhibited the production of the proinflammatory secretome of senescent cells using a JAK inhibitor (JAKi)3,7. In aged (20- to 22-month-old) mice with established bone loss, activation of the INK-ATTAC caspase 8 in senescent cells or treatment with senolytics or the JAKi for 2–4 months resulted in higher bone mass and strength and better bone microarchitecture than in vehicle-treated mice. The beneficial effects of targeting senescent cells were due to lower bone resorption with either maintained (trabecular) or higher (cortical) bone formation as compared to vehicle-treated mice. In vitro studies demonstrated that senescent-cell conditioned medium impaired osteoblast mineralization and enhanced osteoclast-progenitor survival, leading to increased osteoclastogenesis. Collectively, these data establish a causal role for senescent cells in bone loss with aging, and demonstrate that targeting these cells has both anti-resorptive and anabolic effects on bone. Given that eliminating senescent cells and/or inhibiting their proinflammatory secretome also improves cardiovascular function4, enhances insulin sensitivity3, and reduces frailty7, targeting this fundamental mechanism to prevent age-related bone loss suggests a novel treatment strategy not only for osteoporosis, but also for multiple age-related comorbidities.

ABSTRACT Although patients with type 2 diabetes (T2D) are at significant risk for well-recognized diabetic complications, including macrovascular disease, retinopathy, nephropathy, and neuropathy, it is also clear that T2D patients are at increased risk for fragility fractures. Furthermore, fragility fractures in patients with T2D occur at higher bone mineral density (BMD) values compared to nondiabetic controls, suggesting abnormalities in bone material strength (BMS) and/or bone microarchitecture (bone “quality”). Thus, we performed in vivo microindentation testing of the tibia to directly measure BMS in 60 postmenopausal women (age range, 50–80 years) including 30 patients diagnosed with T2D for &gt;10 years and 30 age-matched, nondiabetic controls. Regional BMD was measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA); cortical and trabecular bone microarchitecture was assessed from high-resolution peripheral quantitative computed tomography (HRpQCT) images of the distal radius and tibia. Compared to controls, T2D patients had significantly lower BMS: unadjusted (−11.7%; p &lt; 0.001); following adjustment for body mass index (BMI) (−10.5%; p &lt; 0.001); and following additional adjustment for age, hypertension, nephropathy, neuropathy, retinopathy, and vascular disease (−9.2%; p = 0.022). By contrast, after adjustment for confounding by BMI, T2D patients had bone microarchitecture and BMD that were not significantly different than controls; however, radial cortical porosity tended to be higher in the T2D patients. In addition, patients with T2D had significantly reduced serum markers of bone turnover (all p &lt; 0.001) compared to controls. Of note, in patients with T2D, the average glycated hemoglobin level over the previous 10 years was negatively correlated with BMS (r = −0.41; p = 0.026). In conclusion, these findings represent the first demonstration of compromised BMS in patients with T2D. Furthermore, our results confirm previous studies demonstrating low bone turnover in patients with T2D and highlight the potential detrimental effects of prolonged hyperglycemia on bone quality. Thus, the skeleton needs to be recognized as another important target tissue subject to diabetic complications. © 2014 American Society for Bone and Mineral Research.

ABSTRACT Cellular senescence is a fundamental mechanism by which cells remain metabolically active yet cease dividing and undergo distinct phenotypic alterations, including upregulation of p16Ink4a, profound secretome changes, telomere shortening, and decondensation of pericentromeric satellite DNA. Because senescent cells accumulate in multiple tissues with aging, these cells and the dysfunctional factors they secrete, termed the senescence-associated secretory phenotype (SASP), are increasingly recognized as promising therapeutic targets to prevent age-related degenerative pathologies, including osteoporosis. However, the cell type(s) within the bone microenvironment that undergoes senescence with aging in vivo has remained poorly understood, largely because previous studies have focused on senescence in cultured cells. Thus in young (age 6 months) and old (age 24 months) mice, we measured senescence and SASP markers in vivo in highly enriched cell populations, all rapidly isolated from bone/marrow without in vitro culture. In both females and males, p16Ink4a expression by real-time quantitative polymerase chain reaction (rt-qPCR) was significantly higher with aging in B cells, T cells, myeloid cells, osteoblast progenitors, osteoblasts, and osteocytes. Further, in vivo quantification of senescence-associated distension of satellites (SADS), ie, large-scale unraveling of pericentromeric satellite DNA, revealed significantly more senescent osteocytes in old compared with young bone cortices (11% versus 2%, p &lt; 0.001). In addition, primary osteocytes from old mice had sixfold more (p &lt; 0.001) telomere dysfunction-induced foci (TIFs) than osteocytes from young mice. Corresponding with the age-associated accumulation of senescent osteocytes was significantly higher expression of multiple SASP markers in osteocytes from old versus young mice, several of which also showed dramatic age-associated upregulation in myeloid cells. These data show that with aging, a subset of cells of various lineages within the bone microenvironment become senescent, although senescent myeloid cells and senescent osteocytes predominantly develop the SASP. Given the critical roles of osteocytes in orchestrating bone remodeling, our findings suggest that senescent osteocytes and their SASP may contribute to age-related bone loss. © 2016 American Society for Bone and Mineral Research

Abstract Although cellular senescence drives multiple age-related co-morbidities through the senescence-associated secretory phenotype, in vivo senescent cell identification remains challenging. Here, we generate a gene set (SenMayo) and validate its enrichment in bone biopsies from two aged human cohorts. We further demonstrate reductions in SenMayo in bone following genetic clearance of senescent cells in mice and in adipose tissue from humans following pharmacological senescent cell clearance. We next use SenMayo to identify senescent hematopoietic or mesenchymal cells at the single cell level from human and murine bone marrow/bone scRNA-seq data. Thus, SenMayo identifies senescent cells across tissues and species with high fidelity. Using this senescence panel, we are able to characterize senescent cells at the single cell level and identify key intercellular signaling pathways. SenMayo also represents a potentially clinically applicable panel for monitoring senescent cell burden with aging and other conditions as well as in studies of senolytic drugs.

The ISCD 2007 Pediatric Official Positions define osteoporosis in children on the basis of fracture history and low bone density, adjusted as appropriate for age, gender, and body size. The task force on fracture prediction and osteoporosis definition has reviewed these positions and suggests modifications with respect to vertebral fracture and the definition of a significant fracture history and draws attention to the need to consider degree of trauma as a factor that may modify fracture risk prediction.

Abstract Although cellular senescence is increasingly recognized as driving multiple age-related co-morbidities through the senescence-associated secretory phenotype (SASP), in vivo senescent cell identification, particularly in bulk or single cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data remains challenging. Here, we generated a novel gene set (SenMayo) and first validated its enrichment in bone biopsies from two aged human cohorts. SenMayo also identified senescent cells in aged murine brain tissue, demonstrating applicability across tissues and species. For direct validation, we demonstrated significant reductions in SenMayo in bone following genetic clearance of senescent cells in mice, with similar findings in adipose tissue from humans in a pilot study of pharmacological senescent cell clearance. In direct comparisons, SenMayo outperformed all six existing senescence/SASP gene sets in identifying senescent cells across tissues and in demonstrating responses to senescent cell clearance. We next used SenMayo to identify senescent hematopoietic or mesenchymal cells at the single cell level from publicly available human and murine bone marrow/bone scRNA-seq data and identified monocytic and osteolineage cells, respectively, as showing the highest levels of senescence/SASP genes. Using pseudotime and cellular communication patterns, we found senescent hematopoietic and mesenchymal cells communicated with other cells through common pathways, including the Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) pathway, which has been implicated not only in inflammation but also in immune evasion, an important property of senescent cells. Thus, SenMayo identifies senescent cells across tissues and species with high fidelity. Moreover, using this senescence panel, we were able to characterize senescent cells at the single cell level and identify key intercellular signaling pathways associated with these cells, which may be particularly useful for evolving efforts to map senescent cells ( e.g ., SenNet). In addition, SenMayo represents a potentially clinically applicable panel for monitoring senescent cell burden with aging and other conditions as well as in studies of senolytic drugs.

Senescence drives organismal aging, yet the deep characterization of senescent cells in vivo remains incomplete. Here, we applied mass cytometry by time-of-flight (CyTOF) using carefully validated antibodies to analyze senescent cells at single-cell resolution. We used multiple criteria to identify senescent mesenchymal cells that were growth arrested and resistant to apoptosis (p16+/Ki67-/BCL-2+; "p16KB" cells). These cells were highly enriched for senescence-associated secretory phenotype (SASP) and DNA damage markers and were strongly associated with age. p16KB cell percentages were also increased in CD24+ osteolineage cells, which exhibited an inflammatory SASP in aged mice and were robustly cleared by both genetic and pharmacologic senolytic therapies. Following isolation, CD24+ skeletal cells exhibited growth arrest, SA-βgal positivity, and impaired osteogenesis in vitro . These studies thus provide a new approach using multiplexed protein profiling by CyTOF to define senescent mesenchymal cells in vivo and identify a highly inflammatory, senescent CD24+ osteolineage population cleared by senolytics.