Several shrimp diseases are new or newly emerged in Asia, including acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND), hepatopancreatic microsporidiosis (HPM), hepatopancreatic haplosporidiosis (HPH), aggregated transformed microvilli (ATM) and covert mortality disease (CMD). In addition to these, white spot disease (WSD), yellow head disease (YHD) and infectious myonecrosis (IMN) continue as the most serious viral threats to shrimp farmers in the region. Other diseases such as monodon slow growth syndrome (MSGS), white tail disease (WTD) and abdominal segment deformity disease (ASDD) are of less concern. In contrast, Taura syndrome virus (TSV) and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) have become innocuous due to the widespread use of highly tolerant specific pathogen free (SPF) stocks of Penaeus (Litopenaeus) vannamei that dominate production. Similarly, diseases caused by monodon baculovirus (MBV) and hepatopancreatic parvovirus (HPV) appear not to affect P. vannamei. Spread of diseases has been promoted by the use of live or fresh broodstock feeds such as polychaetes and clams. Also, shortages in the supply of imported SPF broodstock led some entrepreneurs to employ post larvae (PL) of imported SPF stocks to produce 2nd generation broodstock in open shrimp ponds where they became contaminated and were then used to produce PL for stocking ponds. These practices left the whole shrimp industry vulnerable to rapid spread of the new and newly emerging diseases and resulted in the current crisis in Asian shrimp culture. The situation has been exacerbated since 2009 by an almost exclusive focus on AHPND, which is only partially responsible for what has been widely called early mortality syndrome (EMS). The purpose of this review is to summarize progress of research on AHPND bacteria and also to encourage a wider focus on additional pathogens that are causing farm losses. The significance of these diseases and their implications for the future of shrimp aquaculture are discussed. This review summarizes recent information about new and newly emerging diseases of cultured shrimp in Asia and discusses the biosecurity lapses that led to the current shrimp production crisis. All industry stakeholders must be aware of this situation and of the need for regional and global collaborative efforts to stem this crisis and prevent future development of another.

Abstract Cryo-FIB/SEM combined with cryo-ET has emerged from within the field of cryo-EM as the method for obtaining the highest resolution structural information of complex biological samples in-situ in native and non-native environments. However, challenges remain in conventional cryo-FIB/SEM workflows, including milling thick specimens that do not vitrify well, specimens with preferred orientation, low-throughput when milling small and/or low concentration specimens, and cellular specimens that distribute poorly across grid squares. Here we present a general approach we call the ‘Waffle Method’ which leverages high-pressure freezing to address these challenges. We illustrate the mitigation of these challenges by applying the Waffle Method and cryo-ET to reveal the macrostructure of the polar tube in microsporidian spores in multiple complementary orientations, which was previously not possible due to preferred orientation of the spores on the grid. We demonstrate the broadness of the Waffle Method by applying it to three additional cellular samples and a single particle sample using a variety of cryo-FIB-milling hardware, with both manual and automated approaches. We also present a unique and critical stress-relief gap designed specifically for waffled lamellae. Additionally, we describe applications of the Waffle Method which are currently being explored. We propose the Waffle Method as a way to achieve many of the advantages of cryo-liftout on the specimen grid while avoiding the long, challenging, and technically-demanding process required for cryo-liftout.

Abstract Microsporidia are eukaryotic, obligate intracellular parasites that infect a wide range of hosts, leading to health and economic burdens worldwide. Microsporidia use an unusual invasion organelle called the polar tube (PT), which is ejected from a dormant spore at ultra-fast speeds, to infect host cells. The mechanics of PT ejection are impressive. Anncaliia algerae microsporidia spores (3-4 µ m in size) shoot out a 100-nm-wide PT at a speed of 300 µ m/sec, creating a shear rate of 3000 sec −1 . The infectious cargo, which contains two nuclei, is shot through this narrow tube for a distance of ∼60-140 µ m ( Jaroenlak et al., 2020 ) and into the host cell. Considering the large hydraulic resistance in an extremely thin tube and the low-Reynolds-number nature of the process, it is not known how microsporidia can achieve this ultrafast event. In this study, we use Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to capture 3-dimensional snapshots of A. algerae spores in different states of the PT ejection process. Grounded in these data, we propose a theoretical framework starting with a systematic exploration of possible topological connectivity amongst organelles, and assess the energy requirements of the resulting models. We perform PT ring experiments in media of varying viscosity, and use the results to rank our proposed hypotheses based on their predicted energy requirement. We also present a possible mechanism for cargo translocation, and quantitatively compare our predictions to experimental observations. Our study provides a comprehensive biophysical analysis of the energy dissipation of microsporidian infection process and demonstrates the extreme limits of cellular hydraulics. Statement of Signicance Microsporidia are a group of spore-forming, intracellular parasites that infect a wide range of hosts (including humans). Once triggered, microsporidian spores (3-4 µ m in size) shoot out a specialized organelle called the polar tube (PT) (60-140 µ m long, 100 nm wide) at ultrafast speed (300 µ m/sec), penetrating host cells and acting as a conduit for the transport of infectious cargo. Although this process has fascinated biologists for a century, the biophysical mechanisms underlying PT extrusion are not understood. We thus take a data-driven approach to generate models for the physical basis of PT ring and cargo transport through the PT. Our approach here demonstrates the extreme limits of cellular hydraulics and the potential applications of biophysical approaches to other cellular architectures.

Microsporidia, a divergent group of single-celled eukaryotic parasites, harness a specialized harpoon-like invasion apparatus called the polar tube (PT) to gain entry into host cells. The PT is tightly coiled within the transmissible extracellular spore, and is about 20 times the length of the spore. Once triggered, the PT is rapidly ejected and is thought to penetrate the host cell, acting as a conduit for the transfer of infectious cargo into the host. The organization of this specialized infection apparatus in the spore, how it is deployed, and how the nucleus and other large cargo are transported through the narrow PT are not well understood. Here we use serial block-face scanning electron microscopy to reveal the 3-dimensional architecture of the PT and its relative spatial orientation to other organelles within the spore. Using high-speed optical microscopy, we also capture and quantify the entire PT germination process in vitro. Our results show that the emerging PT experiences very high accelerating forces to reach velocities exceeding 300 μm⋅s-1, and that firing kinetics differ markedly between species. Live-cell imaging reveals that the nucleus, which is approximately 7 times larger than the diameter of the PT, undergoes extreme deformation to fit through the narrow tube, and moves at speeds comparable to PT extension. Our study sheds new light on the 3-dimensional organization, dynamics, and mechanism of PT extrusion, and shows how infectious cargo moves through the tube to initiate infection.

Microsporidia are single-celled intracellular parasites that cause opportunistic diseases in humans. Encephalitozoon intestinalis is a prevalent human-infecting species that invades the small intestine. Dissemination to other organ systems is also observed, and is potentially facilitated by macrophages. The macrophage response to infection and the developmental trajectory of the parasite are not well studied. Here we use single cell RNA sequencing to investigate transcriptional changes in both the host and parasite during infection. While a small population of infected macrophages mount a response, most remain transcriptionally unchanged, suggesting that the majority of parasites may avoid host detection. The parasite transcriptome reveals large transcriptional changes throughout the life cycle, providing a blueprint for parasite development. The stealthy microsporidian lifestyle likely allows these parasites to harness macrophages for replication and dissemination. Together, our data provide insights into the host response in primary human macrophages and the E. intestinalis developmental program.