Abstract Cas9-mediated gene editing is a powerful tool for addressing research questions in arthropods. Current approaches rely upon delivering Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complex by embryonic microinjection, which is challenging, is limited to a small number of species, and is inefficient even in optimized taxa. Here we develop a technology termed Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo (ReMOT Control) to deliver Cas9 RNP to the arthropod germline by injection into adult female mosquitoes. We identify a peptide (P2C) that mediates transduction of Cas9 RNP from the female hemolymph to the developing mosquito oocytes, resulting in heritable gene editing of the offspring with efficiency as high as 0.3 mutants per injected mosquito. We demonstrate that P2C functions in six mosquito species. Identification of taxa-specific ovary-specific ligand–receptor pairs may further extend the use of ReMOT Control for gene editing in novel species.

Abstract Zika virus (ZIKV) is a historically neglected flavivirus that has recently caused epidemics in the western hemisphere. ZIKV has been associated with severe symptoms including infant microcephaly and Guillain Barré syndrome, stimulating interest in understanding factors governing ZIKV infection. Heat shock protein 70 (Hsp70) has been shown to be an infection factor for multiple viruses. We investigated the role of Hsp70 in the ZIKV infection process. We localized Hsp70 protein to the Vero cell membrane surface by confocal microscopy and demonstrated that, inside the cell, there is significant co-localization between Hsp70 and ZIKV E protein. Inducing and suppressing Hsp70 expression increased and decreased ZIKV production, respectively. Antibody blocking cell surface-localized Hsp70 decreased ZIKV cell infection rates and production of infectious virus particles, as did competition with recombinant Hsp70 protein. Our data suggest that Hsp70 is an important factor in the ZIKV infection process. Understanding the interactions between Hsp70 and ZIKV may lead to novel therapeutics for ZIKV infection, particularly for pregnant women and fetuses.

2. Abstract Wolbachia pipientis (= Wolbachia ) has promise as a tool to suppress virus transmission by Aedes aegypti mosquitoes. However, Wolbachia can have variable effects on mosquito-borne viruses. This variation remains poorly characterized, yet the multimodal effects of Wolbachia on diverse pathogens could have important implications for public health. Here, we examine the effects of somatic infection with two strains of Wolbachia ( w AlbB and w Mel) on the alphaviruses Sindbis virus (SINV), O’nyong-nyong virus (ONNV), and Mayaro virus (MAYV) in Ae. aegypti . We found variable effects of Wolbachia including enhancement and suppression of viral infections, with some effects depending on Wolbachia strain. Both w AlbB- and w Mel-infected mosquitoes showed enhancement of SINV infection rates one week post-infection, with w AlbB-infected mosquitoes also having higher viral titers than controls. Infection rates with ONNV were low across all treatments and no significant effects of Wolbachia were observed. The effects of Wolbachia on MAYV infections were strikingly strain-specific; w Mel strongly blocked MAYV infections and suppressed viral titers, while w AlbB did not influence MAYV infection. The variable effects of Wolbachia on vector competence underscore the importance of further research into how this bacterium impacts the virome of wild mosquitoes including the emergent human pathogens they transmit. Impact statement In recent years, wild populations of Aedes aegypti mosquitoes have been deliberately infected with Wolbachia —a bacterium that helps to curb the spread of some pathogens including dengue virus. But how does Wolbachia affect the ability of mosquitoes to become infected with and spread the many different viruses they encounter in nature? Here, we characterize the effects of Wolbachia on three alphaviruses that cause illness in humans— Sindbis virus, O’nyong-nyong virus, and Mayaro virus. We find Wolbachia has variable effects on these pathogens, including significant enhancement of Sindbis virus infections. Our research has important implications for the design of vector control strategies, and suggests further research is needed to understand how Wolbachia shapes the replication and transmission of diverse viruses. 3. Data Summary All data in the study are available in the Figures and supplementary material.

Enhanced host immunity and competition for metabolic resources are two main competing hypotheses for the mechanism of Wolbachia-mediated pathogen inhibition in arthropods. Using an Anopheles mosquito - somatic Wolbachia infection - O'nyong nyong virus (ONNV) model, we demonstrate that the mechanism underpinning Wolbachia-mediated virus inhibition is up-regulation of the Toll innate immune pathway. However, the viral inhibitory properties of Wolbachia were abolished by cholesterol supplementation. This result was due to Wolbachia-dependent cholesterol-mediated suppression of Toll signaling rather than competition for cholesterol between Wolbachia and virus. The inhibitory effect of cholesterol was specific to Wolbachia-infected Anopheles mosquitoes and cells. These data indicate that both Wolbachia and cholesterol influence Toll immune signaling in Anopheles mosquitoes in a complex manner and provide a functional link between the host immunity and metabolic competition hypotheses for explaining Wolbachia-mediated pathogen interference in mosquitoes. In addition, these results provide a mechanistic understanding of the mode of action of Wolbachia-induced pathogen blocking in Anophelines, which is critical to evaluate the long-term efficacy of control strategies for malaria and Anopheles-transmitted arboviruses.

Abstract Mosquito bites transmit a number of human pathogens resulting in potentially fatal diseases including malaria, dengue, chikungunya, West Nile encephalitis, and Zika. Although female mosquitoes transmit pathogens via salivary droplets deposited during blood feeding on a host, very little is known about the genomic content of these nanoliter scale droplets, including the transmission dynamics of live pathogens. Here we introduce Vectorchip , a low-cost, scalable microfluidic platform for molecular interrogation of individual mosquito bites in a high-throughput fashion. An ultra-thin PDMS membrane coupled to a microfluidic chip acts as a biting interface, through which freely-behaving mosquitoes deposit saliva droplets by biting into isolated arrayed micro-wells enabling molecular interrogation of individual bites. By modulating membrane thickness, the device enables on-chip comparison of biting capacity and provides a mechanical filter allowing selection of a specific mosquito species. Utilizing Vectorchip , we show on-chip simultaneous detection of mosquito DNA as well as viral RNA from Zika infected Aedes aegypti mosquitoes – demonstrating multiplexed high-throughput screening of vectors and pathogens. Focus-forming assays performed on-chip quantify number of infectious viral particles transmitted during mosquito bites, enabling assessment of active virus transmission. The platform presents a promising approach for single-bite-resolution laboratory and field characterization of vector pathogen communities, to reveal the intricate dynamics of pathogen transmission, and could serve as powerful early warning artificial “sentinel” for mosquito-borne diseases.

Abstract Autophagy is a critical modulator of pathogen invasion response in vertebrates and invertebrates. However, how it affects mosquito-borne viral pathogens that significantly burden public health remains underexplored. To address this gap, we use a genetic approach to activate macroautophagy/autophagy in the yellow fever mosquito ( Aedes aegypti ), infected with a recombinant Sindbis virus (SINV) expressing an autophagy activator. We first demonstrate a 17- amino acid peptide derived from the Ae. aegypti autophagy-related protein 6 (ATG-6/beclin-1-like protein) is sufficient to induce autophagy in C6/36 mosquito cells, as marked by lipidation of ATG- 8 and puncta formation. Next, we engineered a recombinant SINV expressing this bioactive beclin- 1-like peptide and used it to infect and induce autophagy in adult mosquitoes. We find that modulation of autophagy using this recombinant SINV negatively regulated production of infectious viruses. The results from this study improve our understanding of the role of autophagy in arboviruses in invertebrate hosts and also highlight the potential for the autophagy pathway to be exploited for arboviral control.

Abstract Background microRNAs (miRNAs) represent a group of small non-coding RNAs that are crucial gene regulators of important biological functions including development and pathogen defense in most living organisms. Presently, there is a lack of availability of information regarding the miRNAs in the mosquito Culex tarsalis , which is one of the most important vectors of West Nile virus (WNV) in the United States. We used small RNA sequencing data and in vitr o and in vivo experiments to identify and validate the presence of a repertoire of miRNAs in Cx. tarsalis mosquitoes. Results Using bioinformatic approaches we analyzed small RNA sequencing data from the Cx. tarsalis CT embryonic cell line to discover 86 miRNAs. Consistent with other mosquitoes such as Aedes albopictus and Cx. quinquefasciatus , mi-184 was found to be the most abundant miRNA in Cx tarsalis . We also identified an additional 20 novel miRNAs from the recently sequenced Cx. tarsalis genome, for a total of 106 miRNAs identified in this study. The presence of selected miRNAs was biologically validated in both cell line and adult Cx. tarsalis mosquitoes using RT-qPCR and sequencing. Conclusions Cx. tarsalis is an important vector of many medically important pathogens including WNV and Western Equine encephalitis. Here we report a detailed insight into the miRNA population in Cx. tarsalis mosquitoes. These results will open new avenues of research deciphering the role of miRNAs in different Cx. tarsalis biological events such as development, metabolism, immunity and pathogen infection.

Wolbachia pipientis (= Wolbachia ) has promise as a tool to suppress virus transmission by Aedes aegypti mosquitoes. However, Wolbachia can have variable effects on mosquito-borne viruses. This variation remains poorly characterized, yet the multimodal effects of Wolbachia on diverse pathogens could have important implications for public health. Here, we examine the effects of transient somatic infection with two strains of Wolbachia ( w AlbB and w Mel) on the alphaviruses Sindbis virus (SINV), O’nyong-nyong virus (ONNV), and Mayaro virus (MAYV) in Ae . aegypti . We found variable effects of Wolbachia including enhancement and suppression of viral infections, with some effects depending on Wolbachia strain. Both w AlbB- and w Mel-infected mosquitoes showed enhancement of SINV infection rates one week post-infection, with w AlbB-infected mosquitoes also having higher viral titers than controls. Infection rates with ONNV were low across all treatments and no significant effects of Wolbachia were observed. The effects of Wolbachia on MAYV infections were strikingly strain-specific; w Mel strongly blocked MAYV infections and suppressed viral titers, while w AlbB had more modest effects. The variable effects of Wolbachia on vector competence underscore the importance of further research into how this bacterium impacts the virome of wild mosquitoes including the emergent human pathogens they transmit.

The Togavirus (Alphavirus) Mayaro virus (MAYV) was initially described in 1954 from Mayaro County (Trinidad) and has been responsible for outbreaks in South America and the Caribbean. Imported MAYV cases are on the rise, leading to invasion concerns similar to Chikungunya and Zika viruses. Little is known about the range of mosquito species that are competent MAYV vectors. We tested vector competence of 2 MAYV genotypes for six mosquito species (Aedes aegypti, Anopheles gambiae, An. stephensi, An. quadrimaculatus, An. freeborni, Culex quinquefasciatus). Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus were poor MAYV vectors, and either were poorly infected or poorly transmitted. In contrast, all Anopheles species were able to transmit MAYV, and 3 of the 4 species transmitted both genotypes. The Anopheles species tested are divergent and native to widely separated geographic regions, suggesting that Anopheles may be important in the invasion and spread of MAYV across diverse regions of the world.

Abstract Mayaro virus (MAYV) is an emerging new world alphavirus (genus Alphavirus , family Togaviridae) that causes acute multiphasic febrile illness, skin rash, polyarthritis, and occasional severe clinical phenotypes. The virus lifecycle alternates between invertebrate and vertebrate hosts. Here we characterize the replication features, cell entry, life cycle, and virus-related cell pathology of MAYV using vertebrate and invertebrate in vitro models. Electron dense clathrin-coated pits in infected cells, and reduced viral production in the presence of dynasore, ammonium chloride, and bafilomycin, indicates that viral entry occurs through pH-dependent endocytosis. Increase in FITC-dextran uptake (an indicator of macropinocytosis) in MAYV-infected cells, and dose-dependent infection inhibition by 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (a macropinocytosis inhibitor), indicated that macropinocytosis is an additional entry mechanism of MAYV in vertebrate cells. Acutely infected vertebrate and invertebrate cells formed cytoplasmic or membrane-associated extracytoplasmic replication complexes. Mosquito cells showed modified hybrid cytoplasmic vesicles that supported virus replication, nucleocapsid production, and maturation. Mature virus particles were released from cells by both exocytosis and budding from the cell membrane. MAYV replication was cytopathic and associated with induction of apoptosis by the intrinsic pathway, and later by the extrinsic pathway in infected vertebrate cells. Given that MAYV is expanding its geographical existence as a potential public health problem, this study lays the foundation of biological understanding valuable for therapeutic and preventive interventions.