2. Abstract Wolbachia pipientis (= Wolbachia ) has promise as a tool to suppress virus transmission by Aedes aegypti mosquitoes. However, Wolbachia can have variable effects on mosquito-borne viruses. This variation remains poorly characterized, yet the multimodal effects of Wolbachia on diverse pathogens could have important implications for public health. Here, we examine the effects of somatic infection with two strains of Wolbachia ( w AlbB and w Mel) on the alphaviruses Sindbis virus (SINV), O’nyong-nyong virus (ONNV), and Mayaro virus (MAYV) in Ae. aegypti . We found variable effects of Wolbachia including enhancement and suppression of viral infections, with some effects depending on Wolbachia strain. Both w AlbB- and w Mel-infected mosquitoes showed enhancement of SINV infection rates one week post-infection, with w AlbB-infected mosquitoes also having higher viral titers than controls. Infection rates with ONNV were low across all treatments and no significant effects of Wolbachia were observed. The effects of Wolbachia on MAYV infections were strikingly strain-specific; w Mel strongly blocked MAYV infections and suppressed viral titers, while w AlbB did not influence MAYV infection. The variable effects of Wolbachia on vector competence underscore the importance of further research into how this bacterium impacts the virome of wild mosquitoes including the emergent human pathogens they transmit. Impact statement In recent years, wild populations of Aedes aegypti mosquitoes have been deliberately infected with Wolbachia —a bacterium that helps to curb the spread of some pathogens including dengue virus. But how does Wolbachia affect the ability of mosquitoes to become infected with and spread the many different viruses they encounter in nature? Here, we characterize the effects of Wolbachia on three alphaviruses that cause illness in humans— Sindbis virus, O’nyong-nyong virus, and Mayaro virus. We find Wolbachia has variable effects on these pathogens, including significant enhancement of Sindbis virus infections. Our research has important implications for the design of vector control strategies, and suggests further research is needed to understand how Wolbachia shapes the replication and transmission of diverse viruses. 3. Data Summary All data in the study are available in the Figures and supplementary material.

Abstract Reinfections with SARS-CoV-2 have already been documented in humans, although its real incidence is currently unknown. Besides having great impact on public health, this phenomenon raises the question if immunity generated by a single infection is sufficient to provide sterilizing/protective immunity to a subsequent SARS-CoV-2 re-exposure. The Golden Syrian hamster is a manageable animal model to explore immunological mechanisms able to counteract COVID-19, as it recapitulates pathological aspects of mild to moderately affected patients. Here, we report that SARS-CoV-2-inoculated hamsters resolve infection in the upper and lower respiratory tracts within seven days upon inoculation with the Cat01 (G614) SARS-CoV-2 isolate. Three weeks after primary challenge, and despite high titers of neutralizing antibodies, half of the animals were susceptible to reinfection by both identical (Cat01, G614) and variant (WA/1, D614) SARS-CoV-2 isolates. However, upon re-inoculation, only nasal tissues were transiently infected with much lower viral replication than those observed after the first inoculation. These data indicate that a primary SARS-CoV-2 infection is not sufficient to elicit a sterilizing immunity in hamster models but protects against lung disease.

ABSTRACT Mayaro virus (MAYV) is an arboviral pathogen in the genus Alphavirus that is circulating in South America with potential to spread to naïve regions. MAYV is also one of the few viruses with the ability to be transmitted by mosquitoes in the genus Anopheles , as well as the typical arboviral transmitting mosquitoes in the genus Aedes . Few studies have investigated the infection response of Anopheles mosquitoes. In this study we detail the transcriptomic and small RNA responses of An. stephensi to infection with MAYV via infectious bloodmeal at 2, 7, and 14 days post infection (dpi). 487 unique transcripts were significantly regulated, 78 putative novel miRNAs were identified, and an siRNA response is observed targeting the MAYV genome. Gene ontology analysis of transcripts regulated at each timepoint suggested activation of the Toll pathway at 7 dpi and repression of pathways related to autophagy and apoptosis at 14 dpi. These findings provide a basic understanding of the infection response of An. stephensi to MAYV and help to identify host factors which might be useful to target to inhibit viral replication in Anopheles mosquitoes. AUTHOR SUMMARY Mayaro virus (MAYV) is a mosquito-borne Alphavirus responsible for outbreaks in South America and the Caribbean. In this study we infected Anopheles stephensi with MAYV and sequenced mRNA and small RNA to understand how MAYV infection impacts gene transcription and the expression of small RNAs in the mosquito vector. Genes involved with innate immunity and signaling pathways related to cell death are regulated in response to MAYV infection of An. stephensi , we also discover novel miRNAs and describe the expression patterns of miRNAs, siRNAs, and piRNAs following bloodmeal ingestion. These results suggest that MAYV does induce a molecular response to infection in its mosquito vector species.

The Togavirus (Alphavirus) Mayaro virus (MAYV) was initially described in 1954 from Mayaro County (Trinidad) and has been responsible for outbreaks in South America and the Caribbean. Imported MAYV cases are on the rise, leading to invasion concerns similar to Chikungunya and Zika viruses. Little is known about the range of mosquito species that are competent MAYV vectors. We tested vector competence of 2 MAYV genotypes for six mosquito species (Aedes aegypti, Anopheles gambiae, An. stephensi, An. quadrimaculatus, An. freeborni, Culex quinquefasciatus). Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus were poor MAYV vectors, and either were poorly infected or poorly transmitted. In contrast, all Anopheles species were able to transmit MAYV, and 3 of the 4 species transmitted both genotypes. The Anopheles species tested are divergent and native to widely separated geographic regions, suggesting that Anopheles may be important in the invasion and spread of MAYV across diverse regions of the world.

Abstract Most COVID-19 vaccines are based on the SARS-CoV-2 Spike glycoprotein (S) or their subunits. However, the S shows some structural instability that limits its immunogenicity and production, hampering the development of recombinant S-based vaccines. The introduction of the K986P and V987P (S-2P) mutations increases the production of the recombinant S trimer and, more importantly, its immunogenicity, suggesting that these two parameters are related. However, S-2P still shows some molecular instability and it is produced with low yield. Thus, S-2P production can be further optimized. Here we described a novel set of mutations identified by molecular modelling and located in the S2 region of the Spike that increase S-2P production up to five-fold. Besides their immunogenicity, the efficacy of two representative S-2P-based mutants, S-29 and S-21, protecting from a heterologous SARS-CoV-2 Beta variant challenge was assayed in K18-hACE2 mice (an animal model of severe SARS-CoV-2 disease) and golden Syrian hamsters (GSH) (a moderate disease model). S-21 induced higher level of WH1 and Delta variants neutralizing antibodies than S-2P in K18-hACE2 mice three days after challenge. Viral load in nasal turbinate and oropharyngeal samples were reduced in S-21 and S-29 vaccinated mice. Despite that, only the S-29 protein protected 100% of K18-hACE2 mice from severe disease. When GSH were analyzed, all immunized animals were protected from disease development irrespectively of the immunogen they received. Therefore, the higher yield of S-29, as well as its improved immunogenicity and efficacy protecting from the highly pathogenic SARS-CoV-2 Beta variant, pinpoint the S-29 spike mutant as an alternative to the S-2P protein for future SARS-CoV-2 vaccine development. Authors summary The rapid development of SARS-CoV-2 vaccines have been pivotal in the control of the COVID-19 pandemic worldwide. Most of these vaccines include the S glycoprotein as the main immunogen since this protein, and particularly its receptor binding domain (RBD), is the major target of neutralizing antibodies. SARS-CoV-2 have been evolving from the beginning of the pandemic and several variants with increased transmissibility, pathogenicity or resistance to infection– or vaccine-induced immunity have emerged. Different strategies have been adopted to improve vaccine protection including additional booster doses or the adaptation of the S immunogens to the novel SARS-CoV-2 variants. As a complementary strategy we have identified a combination of non-proline mutations that increase S production by 5-fold (S-29 protein). Despite the sequence of this novel S-29 immunogen is based on the ancestral SARS-CoV-2 WH1 variant, it effectively protects animal model from the highly pathogenic and neutralization resistant SARS-CoV-2 Beta variant. Thus, we describe a novel set of mutations that can increase the production and efficacy of S-based COVID-19 vaccines.

Abstract Autophagy is a critical modulator of pathogen invasion response in vertebrates and invertebrates. However, how it affects mosquito-borne viral pathogens that significantly burden public health remains underexplored. To address this gap, we use a genetic approach to activate macroautophagy/autophagy in the yellow fever mosquito ( Aedes aegypti ), infected with a recombinant Sindbis virus (SINV) expressing an autophagy activator. We first demonstrate a 17- amino acid peptide derived from the Ae. aegypti autophagy-related protein 6 (ATG-6/beclin-1-like protein) is sufficient to induce autophagy in C6/36 mosquito cells, as marked by lipidation of ATG- 8 and puncta formation. Next, we engineered a recombinant SINV expressing this bioactive beclin- 1-like peptide and used it to infect and induce autophagy in adult mosquitoes. We find that modulation of autophagy using this recombinant SINV negatively regulated production of infectious viruses. The results from this study improve our understanding of the role of autophagy in arboviruses in invertebrate hosts and also highlight the potential for the autophagy pathway to be exploited for arboviral control.

Abstract Mayaro virus (MAYV) is an emerging new world alphavirus (genus Alphavirus , family Togaviridae) that causes acute multiphasic febrile illness, skin rash, polyarthritis, and occasional severe clinical phenotypes. The virus lifecycle alternates between invertebrate and vertebrate hosts. Here we characterize the replication features, cell entry, life cycle, and virus-related cell pathology of MAYV using vertebrate and invertebrate in vitro models. Electron dense clathrin-coated pits in infected cells, and reduced viral production in the presence of dynasore, ammonium chloride, and bafilomycin, indicates that viral entry occurs through pH-dependent endocytosis. Increase in FITC-dextran uptake (an indicator of macropinocytosis) in MAYV-infected cells, and dose-dependent infection inhibition by 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (a macropinocytosis inhibitor), indicated that macropinocytosis is an additional entry mechanism of MAYV in vertebrate cells. Acutely infected vertebrate and invertebrate cells formed cytoplasmic or membrane-associated extracytoplasmic replication complexes. Mosquito cells showed modified hybrid cytoplasmic vesicles that supported virus replication, nucleocapsid production, and maturation. Mature virus particles were released from cells by both exocytosis and budding from the cell membrane. MAYV replication was cytopathic and associated with induction of apoptosis by the intrinsic pathway, and later by the extrinsic pathway in infected vertebrate cells. Given that MAYV is expanding its geographical existence as a potential public health problem, this study lays the foundation of biological understanding valuable for therapeutic and preventive interventions.