Tree Refugia Ideas of how and when boreal plants spread to the formerly glaciated parts of the world following the retreat of the glaciers 9000 years ago are long debated. Models of the postglacial spread of boreal plants argue for dispersal from southern refugia; however, Parducci et al. (p. 1083 ) have shown that both spruce and pine were present in small ice-free regions of Scandinavia much earlier than thought. DNA haplotyping confirmed that a remnant mitochondrial type of spruce, once unique to Scandinavia, now lives alongside the more common spruce originating from Eastern Europe. Evidence from lake cores collected from central and northern Norway indicated the survival of conifers as early as 22,000 years before the present, when apart from ice-free pockets, most of Scandinavia was covered by ice.

Abstract Restriction-enzyme (RE)-based next-generation sequencing methods have revolutionized marker-assisted genetic studies; however, the use of REs has limited their widespread adoption, especially in field samples with low-quality DNA and/or small quantities of DNA. Here, we developed a PCR-based procedure to construct reduced representation libraries without RE digestion steps, representing de novo single-nucleotide polymorphism discovery and its genotyping using next-generation sequencing. Using multiplexed inter-simple sequence repeat (ISSR) primers, thousands of genome-wide regions were amplified effectively from a wide variety of genomes, without prior genetic information. We demonstrated: 1) Mendelian gametic segregation of the discovered variants; 2) reproducibility of genotyping by checking its applicability for individual identification; and 3) applicability in a wide variety of species by checking standard population genetic analysis. This approach, called multiplexed ISSR genotyping by sequencing, should be applicable to many marker-assisted genetic studies with a wide range of DNA qualities and quantities.

Summary Standard models of plant speciation assume strictly dichotomous genealogies in which a species, the ancestor, is replaced by two offspring species. The reality in wind-pollinated trees with long evolutionary histories is more complex: species evolve from other species through isolation when genetic drift exceeds gene flow; lineage mixing can give rise to new species (hybrid taxa such as nothospecies and allopolyploids). The multi-copy, potentially multi-locus 5S rDNA is one of few gene regions conserving signal from dichotomous and reticulate evolutionary processes down to the level of intra-genomic recombination. Therefore, it can provide unique insights into the dynamic speciation processes of lineages that diversified tens of millions of years ago. Here, we provide the first high-throughput sequencing (HTS) of the 5S intergenic spacers (5S-IGS) for a lineage of wind-pollinated subtropical to temperate trees, the Fagus crenata – F. sylvatica s.l. lineage, and its distant relative F. japonica. The observed 4,963 unique 5S-IGS variants reflect a complex history of hybrid origins, lineage sorting, mixing via secondary gene flow, and intra-genomic competition between two or more paralogous-homoeologous 5S rDNA lineages. We show that modern species are genetic mosaics and represent a striking case of ongoing reticulate evolution during the past 55 million years. Significance statement The evolution of extra-tropical wind-pollinated tree genera involves dynamic speciation processes. High-throughput sequencing of the multi-copy, potentially multi-locus 5S rDNA reveals a complex history of hybrid origins, lineage sorting and mixing, and intra-genomic competition between paralogous-homeologous loci in the core group of Eurasian beech trees (genus Fagus ) and their distant relative, F. japonica . The modern species are genetic mosaics and represent a striking case of at least 55 million years of ongoing reticulate evolution.

Abstract The rates of appearance of new mutations play a central role in evolution. However, mutational processes in natural environments and their relationship with growth rates are largely unknown, particular in tropical ecosystems with high biodiversity. Here, we examined the somatic mutation landscapes of two tropical trees, Shorea laevis (slow-growing) and S. leprosula (fast-growing), in central Borneo, Indonesia. Using newly-constructed genomes, we identified a greater number of somatic mutations in tropical trees than in temperate trees. In both species, we observed a linear increase in the number of somatic mutations with physical distance between branches. However, we found that the rate of somatic mutation accumulation per meter of growth was 3.7-fold higher in S. laevis than in S. leprosula . This difference in the somatic mutation rate was scaled with the slower growth rate of S. laevis compared to S. leprosula, resulting in a constant somatic mutation rate per year between the two species. We also found that somatic mutations are neutral within an individual, but those mutations transmitted to the next generation are subject to purifying selection. These findings suggest that somatic mutations accumulate with absolute time and older trees have a greater contribution towards generating genetic variation. Significance Statement The significance of our study lies in the discovery of an absolute time-dependent accumulation of somatic mutations in long-lived tropical trees, independent of growth rate. Through a comparative analysis of somatic mutation landscapes in slow- and fast-growing species, we observed a clock-like accumulation of somatic mutations in both species, regardless of their growth rates. Although the majority of somatic mutations were restricted to a single branch, we also identified mutations present in multiple branches, likely transmitted during growth. Our findings suggest that older trees make a greater contribution towards generating genetic variation.

In the circumboreal region, plants often have extremely-wide species ranges. Lagotis minor-glauca species complex widespread from (sub)arctic Asia to Alaska, however, have two allied narrow endemics in northern Japan: a serpentine plant L. takedana endemic to the Yubari Mountains (Mt. Yubari) and a non-serpentine plant L. yesoensis endemic to the Taisetsu Mountains (Mt. Taisetsu). Elucidating their origins sheds light on drivers for secondary-speciation of widespread circumboreal plants. To infer phylogenetic distinctiveness of two narrow endemics with those related taxa, which contained 25 out of all the 29 species of the genus, chloroplast DNA (cpDNA), nuclear ribosomal ITS (nrITS), two low copy nuclear gene (LCN) markers and genome-wide single-nucleotide polymorphism genotyping (MIG-seq) were used. In the result of cpDNA analyses, the Lagotis minor-glauca species complex formed a clade. Within the clade, L. yesoensis and a portion of L. glauca samples formed a subclade. However, monophyly of each of the four species was not supported. In the results of nrITS and two LCN analyses, L. takedana was monophyletic, while monophyly was not recovered for each L. yesoensis, L. glauca, and L. minor. Based on a Bayesian dating analysis using nrITS data, the age of the most recent common ancestor of L. takedana was 0.75 Ma (95% confidence interval: 0.05-1.75 Ma). Possible scenario is that an ancestral linage being adapted to serpentine soils migrated into the alpine habitat of Mt. Yubari, that was formed with mountain uplift by the early Pleistocene, and subsequently reproductively isolated from non-serpentine populations and speciated. The contrasting result of L. yesoensis, that was phylogenetically indistinct, is possibly explained by incorrect taxonomy, or alternatively, shallow history and incomplete lineage sorting. In Mt. Taisetsu, massive volcanic eruptions had occurred since the Early Pleistocene and even after the last glacial period, suggesting that alpine plants have not migrated into and established populations in Mt. Taisetsu until very recently. To fully resolve the phylogeny of the three species L. yesoensis, L. glauca, and L. minor, further analyses using high resolution molecular markers are needed. The present study illustrated that two narrow endemics in northern Japan diverged from the widespread species include phylogenetically distinctive and indistinctive species, owing to historical orogeny and ecological factors.

Abstract Rare or endangered species largely contributing to global biodiversity are essential components of ecosystems. Because genetic diversity depends not only on apparent population size but also demographic processes, the conservation priority of endangered species based on population genetics needs to be assessed by comparison with common congeners and demographic events. In this study, we performed population genetic analysis for Gentiana yakushimensis Makino, a rare and endangered plant species with an isolated distribution on Yakushima Island, Japan. We performed comparison of genetic diversity with the congener ( Gentiana triflora Pall. var. japonica (Kusn.) H.Hara), demographic inference, and bottleneck test based on genome-wide single nucleotide polymorphisms. The result was that G. yakushimensis had an extremely low genetic diversity level and a high inbreeding coefficient level compared to those of the congener. The population of G. yakushimensis was estimated to experience an expansion during the Last Glacial Maximum and a recent bottleneck by the demographic inference and the bottleneck test. Therefore, the low level of genetic diversity of this species might have resulted from the impact of the recent bottleneck and the long-term maintenance of a small population size. Due to the long lifespan of the genus Gentiana , the current level of genetic diversity probably does not reflect a large part of recent demographic events, which requires long-term monitoring of changes in genetic diversity to identify the time lag between the reduction in apparent population size and genetic diversity as a future outlook.

Abstract Global climate change poses a significant threat to the habitat connectivity of cold-water-adapted organisms, leading to species extinctions. Because gene flow is itself a functional connectivity among wild populations, if gene flow is modeled by landscape variables, changes in population connectivity could be predicted. In this study, using a model-based riverscape genetics technique and a hydrological model to estimate water temperature, we inferred the determinants of and future changes in gene flow of the fluvial sculpin Cottus nozawae in the upstream section of the Sorachi River, Hokkaido, Japan. As a result of model selection, stream order, water temperature, slope, and distance were detected as landscape variables affecting the strength of gene flow in each stream section. In particular, the trend of greater gene flow in sections with higher stream order and lower temperature fluctuations or summer water temperatures was pronounced. The map from the model showed that gene flow is overall prevented in small tributaries in the southern area, where spring-fed environments are less prevalent. Estimating future changes in gene flow using future water temperature predictions, genetic connectivity was predicted to decrease dramatically until the end of the 21st century under IPCC representative concentration pathway scenario 8.5 (RCP8.5).

Abstract A key piece of information for ecosystem management is the relationship between the environment and population genetic structure. However, it is difficult to clearly quantify the effects of environmental factors on genetic differentiation because of spatial autocorrelation and analytical problems. In this study, we focused on stream ecosystems and the environmental heterogeneity caused by groundwater and constructed a sampling design in which geographic distance and environmental differences are not correlated. Using multiplexed ISSR genotyping by sequencing (MIG-seq) method, a fine-scale population genetics study was conducted in fluvial sculpin Cottus nozawae , for which summer water temperature is the determinant factor in distribution and survival. There was a clear genetic structure in the watershed. Although a significant isolation-by-distance pattern was detected in the watershed, there was no association between genetic differentiation and water temperature. Instead, asymmetric gene flow from relatively low-temperature streams to high-temperature streams was detected, indicating the importance of low-temperature streams and continuous habitats. The groundwater-focused sampling strategy yielded unexpected results and provided important insights for conservation.

The Calypsoinae orchid genus Dactylostalix, previously considered a monotypic genus endemic to Japan and the Russian Far East (the Kuril Islands and Sakhalin Island), is now redefined to encompass two species. This reclassification is based not only on the examination of type specimens and literature but also on molecular data. While Pergamena uniflora has long been regarded as a synonym of Dactylostalix ringens, it is distinguishable by its shorter scape, smaller flower, less spotted tepals, drooping sepals and lateral petals, labellum with smaller, narrowly triangular to ovate lateral lobes, more distinct keels on the adaxial surface of the lip, and a slender column with a smaller stigma and weakly developed clinandrium. We propose the new combination Dactylostalix uniflora, recognizing it as a distinct species within the genus Dactylostalix. Phylogenetic analysis utilizing genome-wide markers has also demonstrated that the two species are genetically distinct. Our findings, obtained through the integration of morphological data and molecular phylogenetics, indicate that D. uniflora represents a distinct evolutionary lineage from D. ringens. Examination of type specimens has led us to conclude that Calypso japonica, Dactylostalix maculosa, and Dactylostalix ringens f. punctatus are junior synonyms of D. ringens. Additionally, we designate the lectotypes for P. uniflora (= D. uniflora), C. japonica, and D. maculosa.

Abstract Anthropogenic activities have reduced ecotones between the ocean and land, which is likely to threaten the population of brackish‐water brachyuran crabs. To assess the current status of these crabs, we examine the population genetic structures of three semi‐terrestrial brachyuran crabs widely distributed along the coast of the Japan and to clarify factors determining their genetic structures. We collected 184 Orisarma dehaani , 252 Chiromantes haematocheir , and 151 Helice tridens crabs from 36 localities of the Japanese archipelago. Genome‐wide SNP data from these crabs were analyzed using MIG‐seq. Bayesian clustering of STRUCTURE and DAPC analysis were used to identify genetically disturbed populations and to visualize genetic differentiation between local populations. Genetic population structure showed clear differentiation between populations on the Pacific coast of the Tohoku region and on other Japanese coasts in O . dehaani , but not in C . haematocheir or H . tridens . The inbreeding coefficient of O . dehaani was significantly higher on the Pacific coast of the Tohoku region compared to other Japanese coasts. C . haematocheir and H . tridens had homogeneous genetic structures along the Japanese coast, but showed genetic differentiation of a local population at their range limits. Thus, O. dehaani showed little gene flow and clear genetic differentiation between populations in the Tohoku Pacific region and those on other Japanese coasts due to ocean currents. Although such a regional differentiation was not found in C . haematocheir and H . tridens , one population of C . haematocheir was genetically isolated at the edge of its distribution range and likely vulnerable to environmental changes.