Summary Improving effector activity of antigen specific T cells is a major goal in cancer immunotherapy. Despite the identification of several effector T cell (T EFF )-driving transcription factors (TF), the transcriptional coordination of T EFF biology remains poorly understood. We developed an in vivo T cell CRISPR screening platform and identified a novel mechanism restraining T EFF biology through the ETS family TF, Fli1. Genetic deletion of Fli1 enhanced T EFF responses without compromising memory or exhaustion precursors. Fli1 restrained T EFF lineage differentiation by binding to cis -regulatory elements of effector-associated genes. Loss of Fli1 increased chromatin accessibility at ETS:RUNX motifs allowing more efficient Runx3-driven T EFF biology. CD8 T cells lacking Fli1 provided substantially better protection against multiple infections and tumors. These data indicate that Fli1 safeguards the developing CD8 T cell transcriptional landscape from excessive ETS:RUNX-driven T EFF cell differentiation. Moreover, genetic deletion of Fli1 improves T EFF differentiation and protective immunity in infections and cancer.

The transcription factor RUNX1 is mutated in familial platelet disorder with associated myeloid malignancies (FPDMM) and in sporadic myelodysplastic syndrome and leukemia. RUNX1 regulates inflammation in multiple cell types. Here we show that RUNX1 is required in granulocyte-monocyte progenitors (GMPs) to restrict the inflammatory response of neutrophils to toll-like receptor 4 (TLR4) signaling. Loss of RUNX1 in GMPs increased the TLR4 coreceptor CD14 on neutrophils, which contributed to neutrophils’ increased inflammatory cytokine production in response to the TLR4 ligand lipopolysaccharide. RUNX1 loss increased the chromatin accessibility of retrotransposons in GMPs and neutrophils and induced a type I interferon signature characterized by enriched footprints for signal transducer and activator of transcription (STAT1::STAT2) and interferon regulatory factors (IRF) in opened chromatin, and increased expression of interferon-stimulated genes. The overproduction of inflammatory cytokines by neutrophils was reversed by inhibitors of type I IFN signaling. We conclude that RUNX1 restrains the chromatin accessibility of retrotransposons in GMPs and neutrophils, and that loss of RUNX1 increases proinflammatory cytokine production by elevating tonic type I interferon signaling.

Abstract Patients with familial platelet disorder with a predisposition to myeloid malignancy (FPDMM) harbor germline monoallelic mutations in a key hematopoietic transcription factor RUNX1. Previous studies of FPDMM have focused on megakaryocyte (Mk) differentiation, and platelet production and signaling. However, the effects of RUNX1 haploinsufficiency on hematopoietic progenitor cells (HPCs) and subsequent megakaryopoiesis remains incomplete. To address this issue, we studied induced-pluripotent stem cell (iPSC)-derived HPCs (iHPCs) and Mks (iMks) from both patient-derived lines and a wildtype line modified to be RUNX1 haploinsufficient (RUNX1 +/− ), each compared to their isogenic wildtype control. All RUNX1 +/− lines showed decreased iMk yield and depletion of a Mk-biased iHPC subpopulation. To investigate global and local gene expression changes underlying this iHPC shift, single-cell RNA sequencing was performed on sorted FPDMM and control iHPCs. We defined several cell subpopulations in FPDMM Mk-biased iHPCs. Analyses of gene sets upregulated in FPDMM iHPCs indicated enrichment for response to stress, regulation of signal transduction and response to cytokine gene sets. Immunoblotting studies in FPDMM iMks were consistent with these findings, but also identified augmented baseline c-Jun N-terminal kinase (JNK) phosphorylation, known to be activated by transforming growth factor β1 and cellular stressors. J-IN8 and RepSox, small drugs targeting these pathways, corrected quantitative defects in FPDMM iHPC production. These findings were confirmed in adult human CD34 + -derived stem and progenitor cells transduced with lentiviral RUNX1 short-hairpin (sh) RNA to mimic RUNX1 +/− . These mechanistic studies of the defect in megakaryopoiesis in FPDMM suggest druggable pathways for clinical management of thrombocytopenia in affected patients. Key points RUNX1 haploinsufficiency results in a deficiency of megakaryocyte-biased hematopoietic progenitor cells (HPCs). RUNX1 haploinsufficiency elevates druggable proinflammatory and TGFβR1-related pathways in HPCs.

Abstract Hemogenic endothelial (HE) cells in the dorsal aorta undergo an endothelial to hematopoietic transition (EHT) to form lympho-myeloid biased progenitors (LMPs), pre-hematopoietic stem cells (pre-HSCs) and adult-repopulating HSCs. These briefly accumulate in intra-arterial hematopoietic clusters (IAHCs) before being released into the circulation. It is generally assumed that the number of IAHC cells correlates with the number of HSCs. Here we show that changes in the number of IAHC cells, LMPs, and HSCs can be uncoupled. Mutations impairing MyD88-dependent toll-like receptor (TLR) signaling decreased the number of IAHC cells and LMPs but increased the number of HSCs in the aorta-gonad-mesonephros region of mouse embryos. TLR4 -deficient embryos generated normal numbers of HE cells but the proliferation of IAHC cells was decreased. Loss of MyD88-dependent TLR signaling in innate immune myeloid cells had no effect on IAHC cell numbers. Instead, TLR4 deletion in endothelial cells recapitulated the phenotype observed with germline deletion, demonstrating that MyD88-dependent TLR signaling in endothelial cells and/or in IAHCs regulates the balance between generating LMPs and HSCs. Summary Statement Toll-like receptor signaling in endothelial cells restricts the number of hematopoietic stem cells but increases the number of committed progenitors and intra-arterial hematopoietic cluster cells by promoting their proliferation.

Tropomyosins coat actin filaments and impact actin-related signaling and cell morphogenesis. Genome-wide association studies have linked Tropomyosin 1 (TPM1) with human blood trait variation. Prior work suggested that TPM1 regulated blood cell formation in vitro, but it was unclear how or when TPM1 affected hematopoiesis. Using gene-edited induced pluripotent stem cell (iPSC) model systems, TPM1 knockout was found to augment developmental cell state transitions, as well as TNFα and GTPase signaling pathways, to promote hemogenic endothelial (HE) cell specification and hematopoietic progenitor cell (HPC) production. Single-cell analyses showed decreased TPM1 expression during human HE specification, suggesting that TPM1 regulated in vivo hematopoiesis via similar mechanisms. Indeed, analyses of a TPM1 gene trap mouse model showed that TPM1 deficiency enhanced the formation of HE during embryogenesis. These findings illuminate novel effects of TPM1 on developmental hematopoiesis.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate from hemogenic endothelial (HE) cells through an endothelial to hematopoietic cell transition (EHT). Newly formed HSPCs accumulate in intra-arterial clusters (IACs) before colonizing the fetal liver. To examine the cell and molecular transitions during the EHT, and the heterogeneity of HSPCs within IACs, we profiled ∼37,000 cells from the caudal arteries of embryonic day 9.5 (E9.5) to E11.5 mouse embryos by single-cell transcriptome and chromatin accessibility sequencing. We identified an intermediate developmental stage prior to HE that we termed pre-HE, characterized by increased accessibility of chromatin enriched for SOX, FOX, GATA, and SMAD motifs. A developmental bottleneck separates pre-HE from HE, with RUNX1 dosage regulating the efficiency of the pre-HE to HE transition. Distinct developmental trajectories within IAC cells result in two populations of CD45+ HSPCs; an initial wave of lympho-myeloid-biased progenitors, followed by precursors of hematopoietic stem cells (pre-HSCs).

Hematopoietic stem cell (HSC) ontogeny is accompanied by dynamic changes in gene regulatory networks. We performed RNA-Seq and histone mark ChIP-Seq to define the transcriptomes and epigenomes of cells representing key developmental stages of HSC ontogeny in the mouse. The five populations analyzed were embryonic day 10.5 (E10.5) endothelium and hemogenic endothelium from the major arteries (dorsal aorta, umbilical and vitelline), an enriched population of pre-hematopoietic stem cells (pre-HSCs), fetal liver HSCs, and adult bone marrow HSCs. We observed dynamic and combinatorial epigenetic changes that mark regulatory DNA sequences including gene promoters and enhancers. Using epigenetic signatures, we identified enhancers for each developmental stage. Only 12% of enhancers are primed, and 78% are active, suggesting the vast majority of enhancers are established de novo at the developmental stages where they are required to control their target genes, without prior priming in earlier stages. We constructed developmental-stage-specific transcriptional regulatory networks during HSC ontogeny by linking enhancers and predicted bound transcription factors to their target promoters using a novel computational algorithm. Our computational analyses predicted known transcriptional regulators for the endothelial-to-hematopoietic transition, validating our overall approach, and identified putative novel transcription factors whose regulon activities correlate with the emergence of pre-HSCs. We validated roles for the broadly expressed transcription factors SP3 and MAZ in arterial hemogenic endothelium. Our data and computational analyses provide a useful resource for uncovering regulators of HSC formation.