ABSTRACT The eukaryotic polyphosphate (polyP) polymerase VTC complex synthesizes polyP from adenosine triphosphate (ATP) and translocates polyP across the vacuolar membrane to maintain an intracellular phosphate (P i ) homeostasis. To discover how VTC complex solves this fundamental aspect, we determined a cryo-electron microscopy structure of an endogenous VTC complex (Vtc4/Vtc3/Vtc1) from Saccharomyces cerevisiae at 3.1 Å resolution. The structure reveals a heteropentameric architecture of one Vtc4, one Vtc3 and three Vtc1 subunits. The transmembrane region forms a polyP selective channel, probably adopting a resting state conformation, in which a latch-like, horizonal helix of Vtc4 limits the entrance. The catalytic Vtc4 central domain locates on top of the pseudo-symmetric polyP channel, creating a strongly electropositive pathway for nascent polyP that can couple synthesis to translocation. The SPX domain of Vtc4 positively regulates polyP synthesis and regulation of VTC complex. The non-catalytic Vtc3 regulates VTC through a phoshorylatable loop. Our findings, along with the functional data, allow us to propose a mechanism of polyP channel gating and VTC complex activation.

Abstract Current COVID-19 vaccines need to take at least one month to complete inoculation and then become effective. Around 51% global population are still not fully vaccinated. Instantaneous protection is an unmet need among those who are not fully vaccinated. In addition, breakthrough infections caused by SARS-CoV-2 are widely reported. All these highlight the unmet needing for short-term instantaneous prophylaxis (STIP) in the communities where SARS-CoV-2 is circulating. Previously, we reported nanobodies isolated from an alpaca immunized with the spike protein, exhibiting ultrahigh potency against SARS-CoV-2 and its variants. Herein, we found that Nb22, among our previously reported nanobodies, exhibited ultrapotent neutralization against Delta variant with an IC 50 value of 0.41 ng/ml (5.13 pM). Furthermore, the crystal structural analysis revealed that the binding of Nb22 to WH01 and Delta RBDs both effectively blocked the binding of RBD to hACE2. Additionally, intranasal Nb22 exhibited protection against SARS-CoV-2 Delta variant in the post-exposure prophylaxis (PEP) and pre-exposure prophylaxis (PrEP). Of note, intranasal Nb22 also demonstrated high efficacy against SARS-CoV-2 Delta variant in STIP for seven days administered by single dose and exhibited long-lasting retention in the respiratory system for at least one month administered by four doses, providing a means of instantaneous short-term prophylaxis against SARS-CoV-2. Thus, ultrahigh potency, long-lasting retention in the respiratory system as well as stability at room-temperature make the intranasal or inhaled Nb22 to be a potential therapeutic or STIP agent against SARS-CoV-2. Brief summary Nb22 exhibits ultrahigh potency against Delta variant in vitro and is exploited by crystal structural analysis; furthermore, animal study demonstrates high effectiveness in the treatment and short-term instantaneous prophylaxis in hACE2 mice via intranasal administration. Highlights Nb22 exhibits ultrapotent neutralization against Delta variant with an IC 50 value of 0.41 ng/ml (5.13 pM). Structural analysis elucidates the ultrapotent neutralization of Nb22 against Delta variant. Nb22 demonstrates complete protection in the treatment of Delta variant infection in hACE2 transgenic mice. We complete the proof of concept of STIP against SARS-CoV-2 using intranasal Nb22 with ultrahigh potency and long-lasting retention in respiratory system. Graphic Abstract