ABSTRACT Plasmodium falciparum ( Pf ) is causing the greatest malaria burden, yet the liver stages (LS) of this most important parasite species have remained poorly studied. Here, we used a human liver-chimeric mouse model in combination with a novel fluorescent Pf NF54 parasite line ( Pf NF54 csp GFP) to isolate Pf LS-infected hepatocytes and generate transcriptomes that cover the major LS developmental phases in human hepatocytes. RNA-seq analysis of early Pf LS trophozoites two days after infection, revealed a central role of translational regulation in the transformation of the extracellular invasive sporozoite into intracellular LS. The developmental time course gene expression analysis indicated that fatty acid biosynthesis, isoprenoid biosynthesis and iron metabolism are sustaining LS development along with amino acid metabolism and biosynthesis. Countering oxidative stress appears to play an important role during intrahepatic LS development. Furthermore, we observed expression of the variant PfEMP1 antigen-encoding var genes, and we confirmed expression of PfEMP1 protein during LS development. Transcriptome comparison of the late Pf liver stage schizonts with P. vivax ( Pv ) late liver stages revealed highly conserved gene expression profiles among orthologous genes. A notable difference however was the expression of genes regulating sexual stage commitment. While Pv schizonts expressed markers of sexual commitment, the Pf LS parasites were not sexually committed and showed expression of gametocytogenesis repression factors. Our results provide the first comprehensive gene expression profile of the human malaria parasite Pf LS isolated during in vivo intrahepatocytic development. This data will inform biological studies and the search for effective intervention strategies that can prevent infection.

ABSTRACT New drugs targeting multiple stages of the malaria-causing parasite, Plasmodium , are needed to reduce and eliminate malaria worldwide. N -Myristoyltransferase (NMT) is an essential eukaryotic enzyme, and a validated chemically tractable drug target for malaria. Previous efforts have failed to target NMT owing to the low selectivity for the Plasmodium enzyme compared with human NMTs. Herein, we applied a structure-guided approach using previously reported NMT inhibitors as scaffolds to develop a new generation of Plasmodium vivax NMT ( Pv NMT) targeting compounds. We report a series of compounds with IC 50 values in the nM range and an order of magnitude improved selectivity to Plasmodium NMT over human NMT ( Hs NMT). X-ray co-crystallization of Pv NMT with a representative lead compound, 12b , supported the prevailing hypothesis that a conformational difference in a key tyrosine residue of Pv NMT and Hs NMT drives the selectivity between these enzymes. The compounds were triaged based on their selectivity for Pv NMT. They significantly decreased P. falciparum blood-stage parasite load, with IC 50 values ranging from 0.36 μM to 1.25 μM. The compounds exhibited a dose-dependent inhibition of P. vivax liver stage schizont and hypnozoite infection, consistently, in three different P. vivax isolates with IC 50 values ranging from 2.2 μM to 6 μM and from 1.2 μM to 12 μM. Our data provide evidence that NMT inhibitors could be multistage antimalarials, targeting both dormant and developing liver stage parasites, which is essential for malaria elimination. One Sentence Summary Potent and selective N -myristoyltransferase inhibitors of Plasmodium vivax hypnozoites and schizonts were synthesized and tested.

SUMMARY Malaria-causing P. vivax parasites can linger in the human liver for weeks to years, and then reactivate to cause recurrent blood-stage infection. While an important target for malaria eradication, little is known about the molecular features of the replicative and non-replicative states of intracellular P. vivax parasites, or the human host-cell responses to them. Here, we leverage a bioengineered human microliver platform to culture Thai clinical isolates of P. vivax in primary human hepatocytes and conduct transcriptional profiling of infected cultures. By coupling enrichment strategies with bulk and single-cell analyses, we captured both parasite and host transcripts in individual hepatocytes throughout the infection course. We defined host- and state-dependent transcriptional signatures and identified previously unappreciated populations of replicative and non-replicative parasites, sharing features with sexual transmissive forms. We found that infection suppresses transcription of key hepatocyte function genes, and that P. vivax elicits an innate immune response that can be manipulated to control infection. Our work provides an extendible framework and resource for understanding host-parasite interactions and reveals new insights into the biology of malaria dormancy and transmission.

Abstract Early Plasmodium falciparum and P. vivax infection requires parasite replication within host hepatocytes, referred to as liver stage (LS). However, limited understanding of infection dynamics in human LS exists due to species-specificity challenges. Reported here is a reproducible, easy-to-manipulate, and moderate-cost in vivo model to study human Plasmodium LS in mice; the ectopic huLiver model. Ectopic huLiver tumors were generated through subcutaneous injection of the HC-04 cell line and shown to be infectible by both freshly dissected sporozoites and through the bite of infected mosquitoes. Evidence for complete LS development was supported by the transition to blood-stage infection in mice engrafted with human erythrocytes. Additionally, this model was successfully evaluated for its utility in testing antimalarial therapeutics, as supported by primaquine acting as a causal prophylactic against P. falciparum. Presented here is a new platform for the study of human Plasmodium infection with the potential to aid in drug discovery.

Upon transmission to the liver, Plasmodium vivax parasites form replicating schizonts, which continue to initiate blood-stage infection, or dormant hypnozoites that reactivate weeks to months after initial infection. P. vivax phenotypes in the field vary significantly, including the ratio of schizonts to hypnozoites formed and the frequency and timing of relapse. Evidence suggests that both parasite genetics and environmental factors underly this heterogeneity. We previously demonstrated that data on the effect of a panel of kinase inhibitors with overlapping targets on Plasmodium liver stage infection, in combination with a computational approach called kinase regression (KiR), can be used to uncover novel host regulators of infection. Here, we applied KiR to evaluate the extent to which P. vivax liver-stage parasites are susceptible to changes in host kinase activity. We identified a role for a subset of host kinases in regulating schizont and hypnozoite infection and schizont size and characterized overlap as well as variability in host phosphosignaling dependencies between parasite forms and across multiple patient isolates. Striking, our data point to variability in host dependencies across P. vivax isolates, suggesting one possible origin of the heterogeneity observed across P. vivax in the field.

Recent reports from Thailand reveal a substantial surge in

New therapeutics are a priority for preventing and eliminating