Protein glycosylation is an important post-translational modification associated, among others, with diseases and the efficacy of biopharmaceuticals. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-fight (TOF) mass spectrometry (MS) can be performed to study glycosylation in a high-throughput manner, but is hampered by the instability and ionization bias experienced by sialylated glycan species. Stabilization and neutralization of these sialic acids can be achieved by permethylation or by specific carboxyl group derivatization with the possibility of discrimination between α2,3- and α2,6-linked sialic acids. However, these methods typically require relatively pure glycan samples, show sensitivity to side reactions, and need harsh conditions or long reaction times. We established a rapid, robust and linkage-specific high-throughput method for sialic acid stabilization and MALDI-TOF-MS analysis, to allow direct modification of impure glycan-containing mixtures such as PNGase F-released human plasma N-glycome. Using a combination of carboxylic acid activators in ethanol achieved near-complete ethyl esterification of α2,6-linked sialic acids and lactonization of α2,3-linked variants, in short time using mild conditions. Glycans were recovered by hydrophilic interaction liquid chromatography solid phase extraction and analyzed by MALDI-TOF-MS in reflectron positive mode with 2,5-dihydroxybenzoic acid as the matrix substance. Analysis of the human plasma N-glycome allowed high-throughput detection and relative quantitation of more than 100 distinct N-glycan compositions with varying sialic acid linkages.

The N-linked glycosylation of the constant fragment (Fc) of immunoglobulin G has been shown to change during pathological and physiological events and to strongly influence antibody inflammatory properties. In contrast, little is known about Fab-linked N-glycosylation, carried by ∼20% of IgG. Here we present a high-throughput workflow to analyze Fab and Fc glycosylation of polyclonal IgG purified from 5 μl of serum. We were able to detect and quantify 37 different N-glycans by means of MALDI-TOF-MS analysis in reflectron positive mode using a novel linkage-specific derivatization of sialic acid. This method was applied to 174 samples of a pregnancy cohort to reveal Fab glycosylation features and their change with pregnancy. Data analysis revealed marked differences between Fab and Fc glycosylation, especially in the levels of galactosylation and sialylation, incidence of bisecting GlcNAc, and presence of high mannose structures, which were all higher in the Fab portion than the Fc, whereas Fc showed higher levels of fucosylation. Additionally, we observed several changes during pregnancy and after delivery. Fab N-glycan sialylation was increased and bisection was decreased relative to postpartum time points, and nearly complete galactosylation of Fab glycans was observed throughout. Fc glycosylation changes were similar to results described before, with increased galactosylation and sialylation and decreased bisection during pregnancy. We expect that the parallel analysis of IgG Fab and Fc, as set up in this paper, will be important for unraveling roles of these glycans in (auto)immunity, which may be mediated via recognition by human lectins or modulation of antigen binding. The N-linked glycosylation of the constant fragment (Fc) of immunoglobulin G has been shown to change during pathological and physiological events and to strongly influence antibody inflammatory properties. In contrast, little is known about Fab-linked N-glycosylation, carried by ∼20% of IgG. Here we present a high-throughput workflow to analyze Fab and Fc glycosylation of polyclonal IgG purified from 5 μl of serum. We were able to detect and quantify 37 different N-glycans by means of MALDI-TOF-MS analysis in reflectron positive mode using a novel linkage-specific derivatization of sialic acid. This method was applied to 174 samples of a pregnancy cohort to reveal Fab glycosylation features and their change with pregnancy. Data analysis revealed marked differences between Fab and Fc glycosylation, especially in the levels of galactosylation and sialylation, incidence of bisecting GlcNAc, and presence of high mannose structures, which were all higher in the Fab portion than the Fc, whereas Fc showed higher levels of fucosylation. Additionally, we observed several changes during pregnancy and after delivery. Fab N-glycan sialylation was increased and bisection was decreased relative to postpartum time points, and nearly complete galactosylation of Fab glycans was observed throughout. Fc glycosylation changes were similar to results described before, with increased galactosylation and sialylation and decreased bisection during pregnancy. We expect that the parallel analysis of IgG Fab and Fc, as set up in this paper, will be important for unraveling roles of these glycans in (auto)immunity, which may be mediated via recognition by human lectins or modulation of antigen binding. Immunoglobulins are key players of the human immune system. Immunoglobulin G (IgG) 1The abbreviations used are:IgGimmunoglobulin GACNacetonitrileConAconcanavalin AFabantigen binding fragmentFccrystallizable fragmentGlcNAcN-acetylglucosamineHILIChydrophilic interaction liquid chromatographySPEsolid phase extraction. 1The abbreviations used are:IgGimmunoglobulin GACNacetonitrileConAconcanavalin AFabantigen binding fragmentFccrystallizable fragmentGlcNAcN-acetylglucosamineHILIChydrophilic interaction liquid chromatographySPEsolid phase extraction. is the most abundant representative of this group, with serum concentrations of ∼10 mg/ml (1Arnold J.N. Wormald M.R. Sim R.B. Rudd P.M. Dwek R.A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.Annu. Rev. Immunol. 2007; 25: 21-50Crossref PubMed Scopus (992) Google Scholar). It consists of two heavy chains (γ-chains) made up of three constant regions (CH1, CH2, and CH3) and one variable region (VH). Attached to each heavy chain is a light chain (λ or κ). Based on chemical and biological properties, different regions can be distinguished in the IgG molecule: two antigen binding fragments (obtained as F(ab′)2 by IdeS treatment; herein referred to as Fab) and a crystallizable fragment (Fc). The structure of IgG is schematically presented in Fig. 1. immunoglobulin G acetonitrile concanavalin A antigen binding fragment crystallizable fragment N-acetylglucosamine hydrophilic interaction liquid chromatography solid phase extraction. immunoglobulin G acetonitrile concanavalin A antigen binding fragment crystallizable fragment N-acetylglucosamine hydrophilic interaction liquid chromatography solid phase extraction. IgGs are glycoproteins, and N-glycans are present at Asn297 of the CH2 domain. These glycans consist of a constant heptasaccharide core that is often modified by a core fucose and is in part decorated with bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc), galactose(s), and sialic acid(s) (Fig. 1) (1Arnold J.N. Wormald M.R. Sim R.B. Rudd P.M. Dwek R.A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.Annu. Rev. Immunol. 2007; 25: 21-50Crossref PubMed Scopus (992) Google Scholar). The Fc glycans have been extensively studied, and glycosylation changes have been found to be associated with disease (e.g. rheumatoid arthritis) (2Parekh R.B. Dwek R.A. Sutton B.J. Fernandes D.L. Leung A. Stanworth D. Rademacher T.W. Mizuochi T. Taniguchi T. Matsuta K. Takeuchi F. Nagano Y. Miyamoto T. Kobata A. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG.Nature. 1985; 316: 452-457Crossref PubMed Scopus (989) Google Scholar, 3Bondt A. Selman M.H.J. Deelder A.M. Hazes J.M.W. Willemsen S.P. Wuhrer M. Dolhain R.J.E.M. Association between galactosylation of immunoglobulin G and improvement of rheumatoid arthritis during pregnancy is independent of sialylation.J. Proteome Res. 2013; 12: 4522-4531Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar) and aging (4Parekh R. Roitt I. Isenberg D. Dwek R. Rademacher T. Age-related galactosylation of the N-linked oligosaccharides of human serum IgG.J. Exp. Med. 1988; 167: 1731-1736Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar, 5Ruhaak L.R. Uh H.-W. Beekman M. Koeleman C.A.M. Hokke C.H. Westendorp R.G.J. Wuhrer M. Houwing-Duistermaat J.J. Slagboom P.E. Deelder A.M. Decreased levels of bisecting GlcNAc glycoforms of IgG are associated with human longevity.PLoS One. 2010; 5: e12566Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 6Yamada E. Tsukamoto Y. Sasaki R. Yagyu K. Takahashi N. Structural changes of immunoglobulin G oligosaccharides with age in healthy human serum.Glycoconj. J. 1997; 14: 401-405Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar). Several immune regulatory properties have been demonstrated for IgG Fc glycans (7Shields R.L. Lai J. Keck R. O'Connell L.Y. Hong K. Meng Y.G. Weikert S.H.A. Presta L.G. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and antibody-dependent cellular toxicity.J. Biol. Chem. 2002; 277: 26733-26740Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1385) Google Scholar, 8Ferrara C. Grau S. Jäger C. Sondermann P. Brünker P. Waldhauer I. Hennig M. Ruf A. Rufer A.C. Stihle M. Umaña P. Benz J. Unique carbohydrate–carbohydrate interactions are required for high affinity binding between FcγRIII and antibodies lacking core fucose.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011; 108: 12669-12674Crossref PubMed Scopus (542) Google Scholar, 9Malhotra R. Wormald M.R. Rudd P.M. Fischer P.B. Dwek R.A. Sim R.B. Glycosylation changes of IgG associated with rheumatoid arthritis can activate complement via the mannose-binding protein.Nat. Med. 1995; 1: 237-243Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar, 10Rademacher T.W. Williams P. Dwek R.A. Agalactosyl glycoforms of IgG autoantibodies are pathogenic.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994; 91: 6123-6127Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 11Schwab I. Seeling M. Biburger M. Aschermann S. Nitschke L. Nimmerjahn F. B cells and CD22 are dispensable for the immediate antiinflammatory activity of intravenous immunoglobulins in vivo.Eur. J. Immunol. 2012; 42: 3302-3309Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 12Nesspor T.C. Raju T.S. Chin C.N. Vafa O. Brezski R.J. Avidity confers FcgammaR binding and immune effector function to aglycosylated immunoglobulin G1.J. Mol. Recognit. 2012; 25: 147-154Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 13Jung S.T. Reddy S.T. Kang T.H. Borrok M.J. Sandlie I. Tucker P.W. Georgiou G. Aglycosylated IgG variants expressed in bacteria that selectively bind FcgammaRI potentiate tumor cell killing by monocyte-dendritic cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010; 107: 604-609Crossref PubMed Scopus (134) Google Scholar). For example, Fc-linked glycans influence the IgG effector function by altering the three-dimensional structure of the protein, and thereby the binding to Fcγ-receptors (12Nesspor T.C. Raju T.S. Chin C.N. Vafa O. Brezski R.J. Avidity confers FcgammaR binding and immune effector function to aglycosylated immunoglobulin G1.J. Mol. Recognit. 2012; 25: 147-154Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar, 13Jung S.T. Reddy S.T. Kang T.H. Borrok M.J. Sandlie I. Tucker P.W. Georgiou G. Aglycosylated IgG variants expressed in bacteria that selectively bind FcgammaRI potentiate tumor cell killing by monocyte-dendritic cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010; 107: 604-609Crossref PubMed Scopus (134) Google Scholar). Additionally, glycan–glycan interactions occur between IgG and Fcγ-receptor-IIIa (8Ferrara C. Grau S. Jäger C. Sondermann P. Brünker P. Waldhauer I. Hennig M. Ruf A. Rufer A.C. Stihle M. Umaña P. Benz J. Unique carbohydrate–carbohydrate interactions are required for high affinity binding between FcγRIII and antibodies lacking core fucose.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011; 108: 12669-12674Crossref PubMed Scopus (542) Google Scholar), with the presence of a core fucose decreasing this affinity by ∼2 orders of magnitude (7Shields R.L. Lai J. Keck R. O'Connell L.Y. Hong K. Meng Y.G. Weikert S.H.A. Presta L.G. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and antibody-dependent cellular toxicity.J. Biol. Chem. 2002; 277: 26733-26740Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1385) Google Scholar). The Fab portion consists of the heavy chain CH1 and VH regions combined with a light chain and exhibits the antigen binding sites formed by the variable and hypervariable regions of those two chains. N-glycans are known to occur on 15% to 25% of the IgG Fab portions (1Arnold J.N. Wormald M.R. Sim R.B. Rudd P.M. Dwek R.A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.Annu. Rev. Immunol. 2007; 25: 21-50Crossref PubMed Scopus (992) Google Scholar, 14Holland M. Yagi H. Takahashi N. Kato K. Savage C.O. Goodall D.M. Jefferis R. Differential glycosylation of polyclonal IgG, IgG-Fc and IgG-Fab isolated from the sera of patients with ANCA-associated systemic vasculitis.Biochim. Biophys. Acta. 2006; 1760: 669-677Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 15Stadlmann J. Pabst M. Altmann F. Analytical and functional aspects of antibody sialylation.J. Clin. Immunol. 2010; 30: 15-19Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). The Fab N-glycans can be involved in immunomodulation, because they influence the affinity and avidity of antibodies for antigens (16Xu P.-C. Gou S.-J. Yang X.-W. Cui Z. Jia X.-Y. Chen M. Zhao M.-H. Influence of variable domain glycosylation on anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies and anti-glomerular basement membrane autoantibodies.BMC Immunol. 2012; 13: 10Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar, 17Coloma M.J. Trinh R.K. Martinez A.R. Morrison S.L. Position effects of variable region carbohydrate on the affinity and in vivo behavior of an anti-(1→6) dextran antibody.J. Immunol. 1999; 162: 2162-2170PubMed Google Scholar, 18Man Sung C. Scheinberg D.A. Avdalovic N.M. McGraw K. Vasquez M. Caron P.C. Queen C. Genetically engineered deglycosylation of the variable domain increases the affinity of an anti-CD33 monoclonal antibody.Mol. Immunol. 1993; 30: 1361-1367Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar, 19Wright A. Tao M.H. Kabat E.A. Morrison S.L. Antibody variable region glycosylation: position effects on antigen binding and carbohydrate structure.EMBO J. 1991; 10: 2717-2723Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar), as well as antibody half-life (17Coloma M.J. Trinh R.K. Martinez A.R. Morrison S.L. Position effects of variable region carbohydrate on the affinity and in vivo behavior of an anti-(1→6) dextran antibody.J. Immunol. 1999; 162: 2162-2170PubMed Google Scholar, 20Huang L. Biolsi S. Bales K.R. Kuchibhotla U. Impact of variable domain glycosylation on antibody clearance: an LC/MS characterization.Anal. Biochem. 2006; 349: 197-207Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar). The glycans of the Fab have been described as biantennary complex-type structures that are, in contrast to Fc glycans, highly sialylated (21Youings A. Chang S.C. Dwek R.A. Scragg I.G. Site-specific glycosylation of human immunoglobulin G is altered in four rheumatoid arthritis patients.Biochem. J. 1996; 314: 621-630Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar, 22Mimura Y. Ashton P.R. Takahashi N. Harvey D.J. Jefferis R. Contrasting glycosylation profiles between Fab and Fc of a human IgG protein studied by electrospray ionization mass spectrometry.J. Immunol. Methods. 2007; 326: 116-126Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar, 23Anumula K.R. Quantitative glycan profiling of normal human plasma derived immunoglobulin and its fragments Fab and Fc.J. Immunol. Methods. 2012; 382: 167-176Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar). Additionally, high-mannose-type structures have been said to be located on the Fab portion (23Anumula K.R. Quantitative glycan profiling of normal human plasma derived immunoglobulin and its fragments Fab and Fc.J. Immunol. Methods. 2012; 382: 167-176Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar). Pregnancy is known to be associated with overall changes in IgG glycosylation. Indeed, a marked increase of galactosylation and sialylation has been observed in IgG Fc glycosylation during pregnancy (3Bondt A. Selman M.H.J. Deelder A.M. Hazes J.M.W. Willemsen S.P. Wuhrer M. Dolhain R.J.E.M. Association between galactosylation of immunoglobulin G and improvement of rheumatoid arthritis during pregnancy is independent of sialylation.J. Proteome Res. 2013; 12: 4522-4531Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 24Selman M.H.J. Derks R.J.E. Bondt A. Palmblad M. Schoenmaker B. Koeleman C.A.M. van de Geijn F.E. Dolhain R.J.E.M. Deelder A.M. Wuhrer M. Fc specific IgG glycosylation profiling by robust nano-reverse phase HPLC-MS using a sheath-flow ESI sprayer interface.J. Proteomics. 2012; 75: 1318-1329Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 25van de Geijn F.E. Wuhrer M. Selman M.H. Willemsen S.P. de Man Y.A. Deelder A.M. Hazes J.M. Dolhain R.J. Immunoglobulin G galactosylation and sialylation are associated with pregnancy-induced improvement of rheumatoid arthritis and the postpartum flare: results from a large prospective cohort study.Arthritis Res. Ther. 2009; 11: R193Crossref PubMed Scopus (207) Google Scholar). In addition, lectin binding studies suggest changes in Fab glycosylation of IgG during pregnancy (26Zenclussen A.C. Gentile T. Kortebani G. Mazzolli A. Margni R. Asymmetric antibodies and pregnancy.Am. J. Reprod. Immunol. 2001; 45: 289-294Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar), which may be caused by increased levels of progesterone (27Prados M.B. La Blunda J. Szekeres-Bartho J. Caramelo J. Miranda S. Progesterone induces a switch in oligosaccharyltransferase isoform expression: consequences on IgG N-glycosylation.Immunol. Lett. 2011; 137: 28-37Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar). Changes in glycosylation during pregnancy could be one of the mechanisms that contribute to acceptance of the fetal allograft by the maternal immune system (26Zenclussen A.C. Gentile T. Kortebani G. Mazzolli A. Margni R. Asymmetric antibodies and pregnancy.Am. J. Reprod. Immunol. 2001; 45: 289-294Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). Our knowledge on the Fab glycosylation of IgGs from peripheral blood is scarce, which is in part due to difficulty detecting the glycans in a Fab-region-specific manner. Because of the polyclonal nature of serum IgG, one may expect Fab glycans to be attached to a large variety of sequence motifs arising from somatic rearrangements and mutations (28Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity.Nature. 1983; 302: 575-581Crossref PubMed Scopus (3156) Google Scholar), making the analysis of Fab glycopeptides from polyclonal serum IgG very demanding, if feasible at all. Therefore, study of the Fab glycosylation of polyclonal serum IgG has mainly been pursued at the level of released glycans (14Holland M. Yagi H. Takahashi N. Kato K. Savage C.O. Goodall D.M. Jefferis R. Differential glycosylation of polyclonal IgG, IgG-Fc and IgG-Fab isolated from the sera of patients with ANCA-associated systemic vasculitis.Biochim. Biophys. Acta. 2006; 1760: 669-677Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 23Anumula K.R. Quantitative glycan profiling of normal human plasma derived immunoglobulin and its fragments Fab and Fc.J. Immunol. Methods. 2012; 382: 167-176Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar). Difficulties lie in the purification of IgG and the separation of Fc and Fab glycosylation, which is essential for the assignment of the glycans to either part of the IgG molecule. Here we present a high-throughput method for studying Fab glycosylation at the level of released glycans obtained from serum-derived polyclonal IgG. Using state-of-the-art affinity capturing beads and enzymes, we were able to obtain Fab and Fc separately, which, after glycan release, resulted in Fc- and Fab-specific glycan pools. The released glycans were subjected to a novel derivatization protocol resulting in linkage-specific modification of sialic acids, followed by HILIC sample purification and MALDI-TOF-MS. Finally, because marked changes in glycosylation during pregnancy have been described, the technique was applied to consecutive serum samples from a cohort of pregnant women. This approach was chosen to determine the usefulness of this technique in a clinical setting. The method proved to be able to demonstrate pregnancy-related changes in glycosylation of the Fab portion, in addition to the already known changes in Fc glycosylation (3Bondt A. Selman M.H.J. Deelder A.M. Hazes J.M.W. Willemsen S.P. Wuhrer M. Dolhain R.J.E.M. Association between galactosylation of immunoglobulin G and improvement of rheumatoid arthritis during pregnancy is independent of sialylation.J. Proteome Res. 2013; 12: 4522-4531Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 24Selman M.H.J. Derks R.J.E. Bondt A. Palmblad M. Schoenmaker B. Koeleman C.A.M. van de Geijn F.E. Dolhain R.J.E.M. Deelder A.M. Wuhrer M. Fc specific IgG glycosylation profiling by robust nano-reverse phase HPLC-MS using a sheath-flow ESI sprayer interface.J. Proteomics. 2012; 75: 1318-1329Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 25van de Geijn F.E. Wuhrer M. Selman M.H. Willemsen S.P. de Man Y.A. Deelder A.M. Hazes J.M. Dolhain R.J. Immunoglobulin G galactosylation and sialylation are associated with pregnancy-induced improvement of rheumatoid arthritis and the postpartum flare: results from a large prospective cohort study.Arthritis Res. Ther. 2009; 11: R193Crossref PubMed Scopus (207) Google Scholar). Ethanol, trifluoroacetic acid (TFA), sodium dodecyl sulfate (SDS), disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 × 2H2O), hydrochloric acid (HCl), and sodium chloride (NaCl) were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). Hydroxybenzotriazole hydrate, 50% sodium hydroxide (NaOH), and Nonidet P-40 were obtained from Sigma-Aldrich. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride originated from Fluorochem (Hadfield, UK). Peptide:N-glycosidase F was bought from Roche Diagnostics (Mannheim, Germany), 2,5-dihydroxybenzoic acid from Bruker Daltonics (Bremen, Germany), and HPLC SupraGradient ACN from Biosolve (Valkenswaard, The Netherlands). Milli-Q deionized water (R > 18.2 mΩ cm−1; Millipore Q-Gard 2 system, Millipore, Amsterdam, The Netherlands) was used in this study. IgG was captured from 5 μl of serum. The serum is dilluted in 100 uL PBS. Using 10 μl of CaptureSelect IgG-Fc (Hu) beads (Invitrogen Europe, Bleiswijk, The Netherlands) in a 96-well format on an Orochem filter plate (10-μm pore size; Orochem Technologies, Naperville, IL). Alternatively CaptureSelect IgG-CH1 beads (Invitrogen Europe) or Protein G-Sepharose Fast Flow beads (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) were used. The beads were washed three times with 200 μl of PBS on a vacuum manifold before the serum was applied to the beads. Application of the samples to the beads was followed by a 60-min shaking step at room temperature on a multiwell plate shaker with a 1.5-mm orbit at 1000 rpm (VWR, Amsterdam, The Netherlands). After removal of the diluted serum, the beads were washed twice with PBS and twice with digestion buffer (50 mm NaH2PO4/150 mm NaCl; pH 6.6). IgG was specifically cleaved into Fc and Fab portions by recombinant streptococcal IdeS enzyme (tradename FabRICATOR; Genovis, Lund, Sweden) (29von Pawel-Rammingen U. Johansson B.P. Bjorck L. IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G.EMBO J. 2002; 21: 1607-1615Crossref PubMed Scopus (328) Google Scholar). The supplier's protocol was adjusted to simplify our procedure and reduce costs. We used 10 U of enzyme per 50 μg sample (IgG captured from 5 μl of serum, assuming an IgG serum concentration of 10 mg/ml), as compared with 50 U for 50 μg suggested by the supplier. To each sample, 35 μl of digestion buffer was added, containing 10 U of the enzyme. The Fc portions remained attached to the beads, and the flowthrough, containing Fab fragments, was collected via centrifugation (1 min, 50 × g) into V-bottom plates (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) after overnight incubation at 37 °C in a humidified environment. Following the washing steps with 3 × 200 μl of PBS and 3 × 200 μl of Milli-Q deionized water, the Fc portions were eluted using 100 μl of 100 mm HCl and collected into V-bottom plates containing 20 μl of 500 mm NaOH to neutralize the elution liquid and prevent the loss of sialic acids due to the acidic environment. Subsequently, both Fc and Fab samples were dried by vacuum centrifugation. To further investigate the sample purity, we performed proteomics analysis on the Fab-containing flowthrough and Fc- or IgG-containing eluates. The samples were dried in the vacuum centrifuge and reconstituted in 40 μl of 25 mm ammonium bicarbonate with 1 μl of 200 mm DTT. After 1 h of reduction at 60 °C, alkylation was performed with 3 μl of 220 mm iodoacetamide, followed by quenching with DTT and overnight digestion with trypsin (1:50 enzyme:protein ratio). LC–ion trap MS/MS analysis was performed as described previously (30Zauner G. Hoffmann M. Rapp E. Koeleman C.A.M. Dragan I. Deelder A.M. Wuhrer M. Hensbergen P.J. Glycoproteomic analysis of human fibrinogen reveals novel regions of O-glycosylation.J. Proteome Res. 2012; 11: 5804-5814Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar). Peak lists were generated using Data Analysis 4.0 (Bruker Daltonics) with default settings and exported as Mascot generic files. Peptides were identified in the UniProt human 20131211 database (88,473 sequences; 35,069,569 residues) using the Mascot algorithm (Mascot 2.4.1, Matrix Science, London, UK), applying a combined search in Mascot Deamon 2.2.2. A peptide mass tolerance of ±0.5 Da (with the number of 13C = 1) and an MS/MS fragment tolerance of ±0.5 Da were used. Trypsin was designated as the enzyme, and up to one missed cleavage was allowed. Carbamidomethylcysteine was selected as a fixed modification, and oxidation of methionine as a variable modification. Proteins were considered truly detected when hits with at least two unique peptides with a score above 30 were observed. To release the N-glycans from both Fc and Fab, 10 μl of PBS and 20 μl of 2% SDS were added to the dried samples, which then underwent a 15-min incubation at 60 °C. Peptide:N-glycosidase F (0.25 U per sample) was added in 20 μl of a 5× PBS/4% Nonidet P-40 (1:1) solution, and the samples were incubated overnight at 37 °C in a desiccator. The following day, 20 μl of the sample was added to 100 μl of 250 mm 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/250 mm hydroxybenzotriazole in pure ethanol. Ethyl esterification of sialic acids was performed at 37 °C for 1 h, as described before (31Reiding K.R. Blank D. Kuijper D.M. Deelder A.M. Wuhrer M. High-throughput profiling of protein N-glycosylation by MALDI-TOF-MS employing linkage-specific sialic acid esterification.Anal. Chem. 2014; 86 (2014): 5784-5793Crossref PubMed Scopus (253) Google Scholar). The ethyl esterified samples were prepared for cotton HILIC purification by the addition of 100 μl of ACN, followed by a 15-min incubation at −20 °C to precipitate proteins. As a modification of the original cotton HILIC micro-SPE method (32Selman M.H. Hemayatkar M. Deelder A.M. Wuhrer M. Cotton HILIC SPE microtips for microscale purification and enrichment of glycans and glycopeptides.Anal. Chem. 2011; 83: 2492-2499Crossref PubMed Scopus (251) Google Scholar), a piece of cotton thread was used for glycan purification, as detailed in the following: for preparation of the HILIC micro-SPE devices, 20-μl pipette tips (Rainin Instrument, Oakland, CA) were packed with 3-mm cotton thread (180 μg, Pipoos, Utrecht, The Netherlands), which was then conditioned and equilibrated by pipetting 20 μl of Milli-Q deionized water three times and then 20 μl of 85% ACN three times. The sample was then loaded on the cotton by pipetting up and down 20 times. Finally, the cotton was washed three times with 20 μl of 85% ACN containing 1% TFA and three times with 20 μl of 85% ACN, followed by elution in 30 μl of Milli-Q deionized water. One microliter of the glycan eluate was mixed on spot with 5 mg/ml 2,5-dihydroxybenzoic acid in 50% ACN containing 1 mm NaOH on a Bruker AnchorChip plate (part number 209514, 800-μm anchor; Bruker Daltonics) and allowed to dry at ambient temperature. Shortly before measurement, samples were recrystallized with 0.2 μl of EtOH. Measurement was performed using an UltrafleXtreme MALDI-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics) in reflectron positive mode. Automated measurement was performed in flexControl 3.4 Build 119. Random walk through the complete sample was used, with 20,000 shots per walk 200 shots per step at 2000 Hz. Summed spectra were saved. The mass spectrometer was externally calibrated using peptide calibration mix (Bruker Daltonics). The obtained spectra were internally calibrated in flexAnalysis 3.3 Build 80 using a stepwise calibration with initial calibration on the following glycan species ([M+Na]+): H3N4F1 (m/z 1485.534), H4N4F1 (m/z 1647.587), H4N5F1 (m/z 1850.666), H5N4E1 (m/z 1982.708), the second isotopic peak of H5N4F1E2 (m/z 2448.896), and the second isotopic peak of H5N5F1E2 (m/z 2651.975), with a 4 m/z peak picking window using the Snap algorithm. The initial calibration was followed by calibration on five different glycan peaks ([M+Na]+) with a window of 1 m/z: H5N4 (m/z 1663.582), H5N4F1 (m/z 1809.640), H5N4F1E1 (m/z 2128.766), H5N4E2 (m/z 2301.835), and H5N5F1E1 (m/z 2331.845) (H, hexose; N, N-acetylhexosamine; F, fucose; E, ethyl esterified N-acetylneuraminic acid). These 11 calibrants cover the most abundant glycans of total IgG, Fc, and Fab glycan spectra. Calibrated spectra were exported as text files containing all data points with an m/z value and intensity. Internal calibration and export were performed using the flexAnalysis Batch Process (Bruker Daltonics). Using an in-house-developed script for Python (31Reiding K.R. Blank D. Kuijper D.M. Deelder A.M. Wuhrer M. High-throughput profiling of protein N-glycosylation by MALDI-TOF-MS employing linkage-specific sialic acid esterification.Anal. Chem. 2014; 86 (2014): 5784-5793Crossref PubMed Scopus (253) Google Scholar), the spectrum was integrated at the m/z ranges that were calculated based on the theoretical glycan list of 42 theoretical N-glycan compositions. Processing in Python took about 4 s per spectrum. Output was saved as a text file that could be opened with Microsoft Excel 2010 for further analysis. Of the 42 potential glycans, 37 N-glycan compositions were mostly observed with signal-to-noise ratios greater than 3 (supplemental Table S1). The relative abundance of the glycans was calculated after normalization to a total of 100%. For further analysis, the spectra had to pass a quality control set in Excel. Bad spectra were removed on the basis of cutoff criteria. More than 95% of the spectrum had to be explained by glycan peaks with a signal-to-noise ratio greater than 3. Additionally, the extracted data needed to have a total signal of >500,000 for all picked glycans after background subtraction. The glycan data were used to calculate global glycosylation traits: galactosylation; abundance of neutral, monosialylated, or disialylated glycans; fucosylation; bisection; abundance of high-mannose structures; or overall percentage of α2,3- and

Abstract Spatial separation of ions in the gas-phase, providing information about their size as collisional cross-sections, can readily be achieved through ion mobility. The timsTOF Pro series combines a trapped ion mobility device with a quadrupole, collision-cell and a time-of-flight analyser to enable the analysis of ions at great speed. Here, we show that the timsTOF Pro is capable of physically separating N -glycopeptides from non-modified peptides and producing high-quality fragmentation spectra, both beneficial for glycoproteomics analyses of complex samples. The glycan moieties enlarge the size of glycopeptides compared to non-modified peptides, yielding a clear cluster in the mobilogram that, next to increased dynamic range from the physical separation of glycopeptides and non-modified peptides, can be used to make an effective selection filter for directing the mass spectrometer to analytes of interest. This new approach was applied to selected glycoproteins, human plasma- and neutrophil-derived glycopeptides. We show that the achieved physical separation, combined with the focussing of the mass spectrometer, allows for improved extraction of information from the samples, even at shorter LC gradients of 15 min. We validated our approach on human neutrophil and plasma samples of known make-up, in which we captured the anticipated glycan heterogeneity (paucimannose, phosphomannose, high mannose, hybrid and complex glycans) from plasma and neutrophil samples at the expected abundances. As the method is compatible with off-the-shelve data acquisition routines and data analysis software, it can readily be applied by any laboratory with a timsTOF Pro and is reproducible as demonstrated by a comparison between two laboratories.

ABSTRACT Glycosylation is an essential protein modification occurring on the majority of extracellular human proteins, mass spectrometry (MS) being an indispensable tool for its analysis. Not only can MS determine glycan compositions, but also position the glycan at specific sites via glycoproteomics. However, glycans are complex branching structures with monosaccharides interconnected in a variety of biologically relevant linkages - isomeric properties which are invisible when the readout is mass alone. Here, we developed an LC-MS/MS-based workflow for determining glycopeptide isomer ratios. Making use of isomerically-defined glyco(peptide) standards, we observed marked differences in fragmentation behavior between isomer pairs when subjected to collision energy gradients, specifically in terms of galactosylation/sialylation branching and linkage. These behaviors were developed into component variables that allowed relative quantification of isomerism within mixtures. Importantly, at least for small peptides, the isomer quantification appeared largely independent from the peptide portion of the conjugate, allowing broad application of the method.

Sialyltransferases (ST) are key enzymes found in, among others, mammals and bacteria that are responsible for producing sialylated glycans, which play critical roles in human health and disease. However, chemical...

Abstract Recently, a conceptually new mass analyzer was introduced by pairing a quadrupole Orbitrap mass spectrometer with an asymmetric track lossless (Astral ™ ) analyzer. This system provides >200-Hz MS/MS scanning speed, high resolving power and sensitivity, and low-ppm mass accuracy. This instrument allows a narrow-window data-independent (nDIA) strategy, improving sensitivity and reproducibility even when using very short LC gradients. Although this represents a new technical milestone in peptide-centric proteomics, this new system has not yet been evaluated for the analyses of very complex and clinically important proteomes, such as represented by the plasma glycoproteome. Here, we evaluated the Orbitrap Astral mass spectrometer for the analysis of the plasma glycoproteome, and pioneer a dedicated nDIA workflow, themed nGlycoDIA. With substantially adjusted parameters and varying collision energies, nGlycoDIA has clear benefits for plasma glycoproteomics. We tested our method both in glycopeptide enriched and crude plasma, leading to the identification of more than 3000 unique glycoPSMs from 181 glycoproteins, covering a dynamic range of 7 orders of magnitude in the enriched plasma sample in just 40 minutes. In addition, we detect for the first time several glycosylated cytokines that have a reported plasma concentration in the ng/L range. Furthermore, shortening the gradient to 10 min still allows the detection of almost 2500 unique glycoPSMs from enriched plasma, indicating that high-throughput indepth clinical plasma glycoproteomics may be within reach.

α -Lactalbumin, an abundant protein present in the milk of most mammals, is associated with biological, nutritional and technological functionality. Its sequence presents N-glycosylation motifs, the occupancy of which is species-specific, ranging from no to full occupancy. Here, we investigated the N-glycosylation of bovine α-lactalbumin in colostrum and milk sampled from four individual cows, each at 9 time points starting from the day of calving up to 28.0 d post-partum. Using a glycopeptide-centric mass spectrometry-based glycoproteomics approach, we identified N-glycosylation at both Asn residues found in the canonical Asn-Xxx-Ser/Thr motif, i.e. Asn45 and Asn74 of the secreted protein. We found similar glycan profiles in all four cows, with partial site occupancies, averaging at 35% and 4% for Asn45 and Asn74, respectively. No substantial changes in occupancy occurred over lactation at either site. Fucosylation, sialylation, primarily with N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac), and a high ratio of N,N'-diacetyllactosamine (LacdiNAc)/N-acetyllactosamine (LacNAc) motifs were characteristic features of the identified N-glycans. While no substantial changes occurred in site occupancy at either site during lactation, the glycoproteoform (i.e. glycosylated form of the protein) profile revealed dynamic changes; the maturation of the α-lactalbumin glycoproteoform repertoire from colostrum to mature milk was marked by substantial increases in neutral glycans and the number of LacNAc motifs per glycan, at the expense of LacdiNAc motifs. While the implications of α-lactalbumin N-glycosylation on functionality are still unclear, we speculate that N-glycosylation at Asn74 results in a structurally and functionally different protein, due to competition with the formation of its two intra-molecular disulphide bridges.

Abstract Influenza A viruses (IAVs) can overcome species barriers by adaptation of the receptor binding site of the hemagglutinin (HA). To initiate infection, HAs bind to glycan receptors with terminal sialic acids, which are either N -acetylneuraminic acid (NeuAc) or N -glycolylneuraminic acid (NeuGc), the latter is mainly found in horses and pigs but not in birds and humans. We investigated the influence of previously identified equine NeuGc-adapting mutations (S128T, I130V, A135E, T189A, and K193R) in avian H7 IAVs in vitro and in vivo. We observed that these mutations negatively affected viral replication in chicken cells, but not in duck cells, and positively affected replication in horse cells. In vivo , the mutations reduced virus virulence and mortality in chickens. Ducks excreted high viral loads for a longer time than chickens, although they appeared clinically healthy. To elucidate why chickens and ducks were infected by these viruses despite the absence of NeuGc, we re-evaluated the receptor binding of H7 HAs using glycan microarray and flow cytometry studies. This revealed that mutated avian H7 HAs also bound to α2,3-linked NeuAc and sialyl-LewisX, which have an additional fucose moiety in their terminal epitope, explaining why infection of ducks and chickens was possible. Interestingly, the α2,3-linked NeuAc and sialyl-LewisX epitopes were only bound when presented on tri-antennary N -glycans, emphasizing the importance of investigating the fine receptor specificities of IAVs. In conclusion, the binding of NeuGc-adapted H7 IAV to sialyl-LewisX enables viral replication and shedding by chickens and ducks, potentially facilitating interspecies transmission of equine-adapted H7 IAVs. (249 words) Importance Influenza A viruses cause millions of deaths and illness in birds and mammals each year. The viral surface protein hemagglutinin initiates infection by binding to host cell terminal sialic acids. Hemagglutinin adaptations affect the binding affinity to these sialic acids and therefore the potential host species targeted. While avian and human IAVs tend to bind N -acetylneuraminic acid (a form of sialic acid), equine H7 viruses prefer binding to N -glycolylneuraminic acid (NeuGc). To better understand the function of NeuGc-specific adaptations in hemagglutinin and to elucidate interspecies transmission potential NeuGc-adapted viruses, we evaluated the effects of NeuGc-specific mutations in avian H7 viruses in chickens and ducks, important economic hosts and reservoir birds, respectively. We also examined the impact on viral replication and found a binding affinity to sialyl-LewisX, another terminal epitope. These findings are important as they contribute to the understanding of the role of sialyl-LewisX in avian influenza infection. (148 words)

Glycomics measurements, like all other high-throughput technologies, are subject to technical variation due to fluctuations in the experimental conditions. The removal of this non-biological signal from the data is referred to as normalization. Contrary to other omics data types, a systematic evaluation of normalization options for glycomics data has not been published so far. In this paper, we assess the quality of different normalization strategies for glycomics data with an innovative approach. It has been shown previously that Gaussian Graphical Models (GGMs) inferred from glycomics data are able to identify enzymatic steps in the glycan synthesis pathways in a data-driven fashion. Based on this finding, we here quantify the quality of a given normalization method according to how well a GGM inferred from the respective normalized data reconstructs known synthesis reactions in the glycosylation pathway. The method therefore exploits a biological measure of goodness. We analyzed 23 different normalization combinations applied to six large-scale glycomics cohorts across three experimental platforms (LC-ESI-MS, UHPLC-FLD and MALDI-FTICR-MS). Based on our results, we recommend normalizing glycan data using the Probabilistic Quotient method followed by log-transformation, irrespective of the measurement platform.