Loss of the E3 ubiquitin ligase Parkin causes early onset Parkinson's disease, a neurodegenerative disorder of unknown etiology. Parkin has been linked to multiple cellular processes including protein degradation, mitochondrial homeostasis, and autophagy; however, its precise role in pathogenesis is unclear. Recent evidence suggests that Parkin is recruited to damaged mitochondria, possibly affecting mitochondrial fission and/or fusion, to mediate their autophagic turnover. The precise mechanism of recruitment and the ubiquitination target are unclear. Here we show in Drosophila cells that PINK1 is required to recruit Parkin to dysfunctional mitochondria and promote their degradation. Furthermore, PINK1 and Parkin mediate the ubiquitination of the profusion factor Mfn on the outer surface of mitochondria. Loss of Drosophila PINK1 or parkin causes an increase in Mfn abundance in vivo and concomitant elongation of mitochondria. These findings provide a molecular mechanism by which the PINK1/Parkin pathway affects mitochondrial fission/fusion as suggested by previous genetic interaction studies. We hypothesize that Mfn ubiquitination may provide a mechanism by which terminally damaged mitochondria are labeled and sequestered for degradation by autophagy.

Here, Tain et al. describe the genetic interaction between 4E-BP, an inhibitor of translation, with Parkinson's disease–associated park and Pink1 in Drosophila, where the manipulation of 4E-BP reduced the pathologic phenotypes, including degeneration of dopaminergic neurons, in park and Pink1 mutant flies. Mutations in PINK1 and PARK2 cause autosomal recessive parkinsonism, a neurodegenerative disorder that is characterized by the loss of dopaminergic neurons. To discover potential therapeutic pathways, we identified factors that genetically interact with Drosophila park and Pink1. We found that overexpression of the translation inhibitor Thor (4E-BP) can suppress all of the pathologic phenotypes, including degeneration of dopaminergic neurons in Drosophila. 4E-BP is activated in vivo by the TOR inhibitor rapamycin, which could potently suppress pathology in Pink1 and park mutants. Rapamycin also ameliorated mitochondrial defects in cells from individuals with PARK2 mutations. Recently, 4E-BP was shown to be inhibited by the most common cause of parkinsonism, dominant mutations in LRRK2. We also found that loss of the Drosophila LRRK2 homolog activated 4E-BP and was also able to suppress Pink1 and park pathology. Thus, in conjunction with recent findings, our results suggest that pharmacologic stimulation of 4E-BP activity may represent a viable therapeutic approach for multiple forms of parkinsonism.

Abstract LRRK2 is a kinase involved in different cellular functions, including autophagy, endolysosomal pathways and vesicle trafficking. Mutations in LRRK2 cause autosomal dominant forms of Parkinson’s disease (PD). Heterozygous mutations in GBA1 , the gene encoding the lysosomal enzyme glucocerebrosidase (GCase), are the most common genetic risk factors for PD. Moreover, GCase function is altered in idiopathic PD and in other genetic forms of the disease. Recent work suggests that LRRK2 kinase activity can regulate GCase function. However, both a positive and a negative correlation have been described. To gain insights into the impact of LRRK2 on GCase, we investigated GCase levels and activity in LRRK2 G2019S knockin mice, in clinical biospecimens from PD patients carrying this mutation and in patient-derived cellular models. In these models we found a positive correlation between the activities of LRRK2 and GCase, which was further confirmed in cell lines with genetic and pharmacological manipulation of LRRK2 kinase activity. Overall, our study indicates that LRRK2 kinase activity affects both the levels and the catalytic activity of GCase.

Abstract Stress-induced mitophagy, a tightly regulated process that targets dysfunctional mitochondria for autophagy-dependent degradation, mainly relays on two proteins, PINK1 and Parkin, which genes are mutated in some forms of familiar Parkinson’s Disease (PD). Upon mitochondrial damage, the protein kinase PINK1 accumulates on the organelle surface where it controls the recruitment of the E3-ubiquitin ligase Parkin. On mitochondria, Parkin ubiquitinates a subset of mitochondrial resident proteins located on the outer mitochondrial membrane, leading to the recruitment of downstream cytosolic autophagic adaptors, and subsequent autophagosome formation. Importantly, PINK1/Parkin-independent mitophagy pathways also exist that can be counteracted by specific deubiquitinating enzymes (DUBs). Downregulation of these specific DUBs can presumably enhances basal mitophagy, and be beneficial in models in which accumulation of defective mitochondria is implicated. Among these DUBs, USP8 is an interesting target because of its role in the endosomal pathway and autophagy, and its beneficial effects, when inhibited, in models of neurodegeneration. Based on this, we evaluated autophagy and mitophagy levels when USP8 activity is altered. We used genetic approaches in D. melanogaster to measure autophagy and mitophagy in vivo , and complementary in vitro approaches to investigate the molecular pathway that regulates mitophagy via USP8. We found an inverse correlation between basal mitophagy and USP8 levels, in that inhibition of USP8 correlates with increased Parkin-independent mitophagy. These results suggest the existence of a yet uncharacterized mitophagic pathway that is inhibited by USP8.

Abstract Autophagic elimination of depolarized mitochondria (mitophagy) depends on Ubiquitin proteasome complex to expose the inner mitochondrial membrane-resident protein-Prohibitin 2 (PHB2). This uncovering facilitates its interaction with autophagosomal membrane-associated protein LC3. It remains unclear whether PHB2 is uncovered randomly through mitochondrial rupture sites. Prior knowledge and initial screening indicated that Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) might play a role in this process. Through in vitro biochemical assays and imaging, we have found that VDAC1-PHB2 interaction increases during mitochondrial depolarization. Subsequently, this interaction enhances the efficiency of PHB2 exposure and mitophagy. To investigate the relevance in vivo , we utilized a Porin (equivalent to VDAC1) knockout Drosophila line. Our findings demonstrate that during rotenone-induced mitochondrial stress, Porin is essential for PHB2 exposure, PHB2-LC3 interaction, and mitophagy. This study highlights that VDAC1 predominantly synchronizes efficient PHB2 exposure through mitochondrial rupture sites during mitophagy. These findings may provide insights to understand progressive neurodegeneration.

Abstract Selective removal of dysfunctional mitochondria via autophagy is crucial for the maintenance of cellular homeostasis. This event is initiated by the translocation of the E3 ubiquitin ligase Parkin to damaged mitochondria, and it requires the Serine/Threonine-protein kinase PINK1. In a coordinated set of events, PINK1 operates upstream of Parkin in a linear pathway that leads to the phosphorylation of Parkin, Ubiquitin, and Parkin mitochondrial substrates, to promote ubiquitination of outer mitochondrial membrane proteins. Ubiquitin decorated mitochondria are selectively recruiting autophagy receptors,which are required to terminate the organelle via autophagy. In this work we show a previously uncharacterized molecular pathway that correlates the activation of the Ca 2+ -dependent phosphatase Calcineurin to Parkin-dependent mitophagy. Calcineurin downregulation or genetic inhibition prevents Parkin translocation to CCCP-treated mitochondria, and impairs stress-induced mitophagy, whereas Calcineurin activation promotes Parkin mitochondrial recruitment and basal mitophagy. Calcineurin interacts with Parkin, and promotes Parkin translocation in the absence of PINK1, but requires PINK1 expression to execute mitophagy in MEF cells. Genetic activation of Calcineurin in vivo boosts basal mitophagy in neurons, and corrects locomotor dysfunction and mitochondrial respiratory defects of a Drosophila model of impaired mitochondrial functions. Our study identifies Calcineurin as a novel key player in the regulation of Parkin translocation and mitophagy.

Mitochondrial Ca2+ uptake is an important mediator of metabolism and cell death. Identification of components of the highly conserved mitochondrial Ca2+ uniporter has opened it up to genetic analysis in model organisms. Here we report a comprehensive genetic characterisation of the known uniporter components conserved in Drosophila. While loss of MCU or EMRE abolishes fast mitochondrial Ca2+ uptake, this results in surprisingly mild phenotypes. In contrast, loss of the regulatory gatekeeper component MICU1 has a much more severe phenotype, being developmental lethal, consistent with unregulated Ca2+ uptake. Mutants for MICU3 are viable with mild neurological phenotypes. Genetic interaction studies reveal that MICU1 and MICU3 are not functionally interchangeable. More surprisingly, loss of MCU or EMRE does not suppress MICU1 mutant lethality, suggesting that the lethality results from MCU-independent functions. This study helps shed light on the physiological requirements of the mitochondrial Ca2+ uniporter, and provides a suite of tools to interrogate their interplay in homeostasis and disease conditions.

Mitochondrial Ca2+ uptake is an important mediator of metabolism and cell death. Identification of components of the highly conserved mitochondrial Ca2+ uniporter has opened it up to genetic analysis in model organisms. Here we report a comprehensive genetic characterisation of the known uniporter components conserved in Drosophila. While loss of MCU or EMRE abolishes fast mitochondrial Ca2+ uptake, this results in surprisingly mild phenotypes. In contrast, loss of the regulatory gatekeeper component MICU1 has a much more severe phenotype, being developmental lethal, consistent with unregulated Ca2+ uptake. Mutants for MICU3 are viable with mild neurological phenotypes. Genetic interaction studies reveal that MICU1 and MICU3 are not functionally interchangeable. More surprisingly, loss of MCU or EMRE does not suppress MICU1 mutant lethality, suggesting that the lethality results from MCU-independent functions. This study helps shed light on the physiological requirements of the mitochondrial Ca2+ uniporter, and provides a suite of tools to interrogate their interplay in homeostasis and disease conditions.