Abstract Cardiac troponin I (cTnI) is a sarcomeric protein critical to myocyte contraction. Unexpectedly, we found that some cTnI localized to the mitochondrial matrix in the heart, inhibited mitochondrial functions when stably expressed in non-cardiac cells and increased opening of the mitochondrial permeability transition pore under oxidative stress. Direct, specific, and saturable binding of cTnI to ATP synthase was demonstrated in vitro , using immune-captured ATP synthase, and in cells using proximity ligation assay. cTnI binding doubled F 1 F 0 ATPase activity, whereas skeletal troponin I and several human mutant cTnI variants associated with familial hypertrophic cardiomyopathy did not. A rationally-designed ten amino acid peptide, P888, inhibited cTnI binding to ATP synthase, inhibited cTnI-induced increase in ATPase activity in vitro , and reduced cardiac injury following transient ischemia in vivo . We therefore suggest that mitochondria-associated cTnI may inhibit cardiac ATP synthase under basal conditions; pharmacological agents that release this inactivating effect of cTnI and thus preventing ATP hydrolysis during cardiac ischemia may increase the reservoir of functional mitochondria to reduce cardiac injury. Significance Statement Cardiac troponin I (cTnI) is a key sarcomeric protein involved in the regulation of myocardial contractility. We found that some cTnI is present in the mitochondrial matrix where it binds to ATP synthase, disrupting mitochondrial function; inhibition of the cTnI-ATP synthase interaction with a selective peptide inhibitor reduces cardiac dysfunction following ischemia and reperfusion injury. Several pathogenic cTnI mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy do not affect ATP synthase activity, suggesting a potential mechanism that contributes to the diverse pathologies associated with these mutations.

Despite therapeutic advancements, GVHD is a major complication of HSCT. In current models of GVHD, tissue injury induced by cytotoxic conditioning regimens, along with translocation of microbes expressing Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs), result in activation of host antigen-presenting cells (APC) to stimulate alloreactive donor T lymphocytes. Recent studies have demonstrated that in many pathologic states, tissue injury results in the release of mitochondria from the cytoplasm to the extracellular space. We hypothesized that extracellular mitochondria, which are related to archaebacteria, could also trigger GVHD by stimulation of host APC. We found that clinically relevant doses of radiation or busulfan induced extracellular release of mitochondria by various cell types, including cultured intestinal epithelial cells. Conditioning-mediated mitochondrial release was associated with mitochondrial damage and impaired quality control but did not affect the viability of the cells. Extracellular mitochondria directly stimulated host APCs to express higher levels of MHC-II, co-stimulatory CD86, and pro-inflammatory cytokines, resulting in increased donor T cell activation, and proliferation in mixed lymphocyte reactions. Analyses of plasma from both experimental mice and a cohort of children undergoing HSCT demonstrated that conditioning induced extracellular mitochondrial release in vivo. In mice undergoing MHC mismatched HSCT, administration of purified syngeneic extracellular mitochondria increased host APC activation and exacerbated GVHD. Our data suggests that pre-HSCT conditioning results in extracellular release of damaged mitochondria which increase alloreactivity and exacerbate GVHD. Therefore, decreasing the extracellular release of damaged mitochondria following conditioning could serve as a novel strategy for GVHD prevention.