There is substantial interest in the development of drugs that limit the extent of ischemia-induced cardiac damage caused by myocardial infarction or by certain surgical procedures. Here, using an unbiased proteomic search, we identified mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) as an enzyme whose activation correlates with reduced ischemic heart damage in rodent models. A high-throughput screen yielded a small-molecule activator of ALDH2 (Alda-1) that, when administered to rats before an ischemic event, reduced infarct size by 60%, most likely through its inhibitory effect on the formation of cytotoxic aldehydes. In vitro, Alda-1 was a particularly effective activator of ALDH2*2, an inactive mutant form of the enzyme that is found in 40% of East Asian populations. Thus, pharmacologic enhancement of ALDH2 activity may be useful for patients with wild-type or mutant ALDH2 who are subjected to cardiac ischemia, such as during coronary bypass surgery.

Protein kinase C (PKC) translocates from the soluble to the cell particulate fraction on activation. Intracellular receptors that bind activated PKC in the particulate fraction have been implicated by a number of studies. Previous work identified 30- to 36-kDa proteins in the particulate fraction of heart and brain that bound activated PKC in a specific and saturable manner. These proteins were termed receptors for activated C-kinase, or RACKs. In the following study, we describe the cloning of a cDNA encoding a 36-kDa protein (RACK1) that fulfills the criteria for RACKs. (i) RACK1 bound PKC in the presence of PKC activators, but not in their absence. (ii) PKC binding to the recombinant RACK1 was not inhibited by a pseudosubstrate peptide or by a substrate peptide derived from the pseudosubstrate sequence, indicating that the binding did not reflect simply PKC association with its substrate. (iii) Binding of PKC to RACK1 was saturable and specific; two other protein kinases did not bind to RACK1. (iv) RACK1 contains two short sequences homologous to a PKC binding sequence previously identified in annexin I and in the brain PKC inhibitor KCIP. Peptides derived from these sequences inhibited PKC binding to RACK1. Finally, RACK1 is a homolog of the beta subunit of G proteins, which were recently implicated in membrane anchorage of the beta-adrenergic receptor kinase [Pitcher, J., Inglese, L., Higgins, J. B., Arriza, J. A., Casey, P. J., Kim, C., Benovic, J. L., Kwatra, M. M., Caron, M. G. & Lefkowitz, R. J. (1992) Science 257, 1264-1267]. Our in vitro data suggest a role for RACK1 in PKC-mediated signaling.

Protein kinase C (PKC) isozymes comprise a family of related enzymes. There are only limited differences between these isozymes in substrate specificity or sensitivity to activators. However, there are multiple isozymes within a cell mediating isozyme-specific functions. Differential subcellular localization has been proposed to explain this specificity. When members of the PKC family are activated by lipid-derived second messengers, they translocate from one cell compartment to another. Isozyme specificity appears to be mediated in part by association of each PKC isozyme with specific anchoring proteins. This review will cover the proteins involved in the anchoring of PKC isozymes at specific subcellular sites, the domains in the PKC isozymes that mediate protein-protein interaction with isozyme-specific anchoring proteins, and identification of peptides that interfere with or promote these protein-protein interactions, thus altering the localization and function of individual isozymes.

Conflicting roles for protein kinase C (PKC) isozymes in cardiac disease have been reported. Here, deltaPKC-selective activator and inhibitor peptides were designed rationally, based on molecular modeling and structural homology analyses. Together with previously identified activator and inhibitor peptides of epsilonPKC, deltaPKC peptides were used to identify cardiac functions of these isozymes. In isolated cardiomyocytes, perfused hearts, and transgenic mice, deltaPKC and epsilonPKC had opposing actions on protection from ischemia-induced damage. Specifically, activation of epsilonPKC caused cardioprotection whereas activation of deltaPKC increased damage induced by ischemia in vitro and in vivo. In contrast, deltaPKC and epsilonPKC caused identical nonpathological cardiac hypertrophy; activation of either isozyme caused nonpathological hypertrophy of the heart. These results demonstrate that two related PKC isozymes have both parallel and opposing effects in the heart, indicating the danger in the use of therapeutics with nonselective isozyme inhibitors and activators. Moreover, reduction in cardiac damage caused by ischemia by perfusion of selective regulator peptides of PKC through the coronary arteries constitutes a major step toward developing a therapeutic agent for acute cardiac ischemia.

Protein kinase C (PKC) translocates from the cytosol to the particulate fraction on activation. This activation-induced translocation of PKC is thought to reflect PKC binding to the membrane lipids. However, immunological and biochemical data suggest that PKC may bind to proteins in the cytoskeletal elements in the particulate fraction and in the nuclei. Here we describe evidence for the presence of intracellular receptor proteins that bind activated PKC. Several proteins from the detergent-insoluble material of the particulate fraction bound PKC in the presence of phosphatidylserine and calcium; binding was further increased with the addition of diacylglycerol. Binding of PKC to two of these proteins was concentration-dependent, saturable, and specific, suggesting that these binding proteins are receptors for activated C-kinase, termed here "RACKs." PKC binds to RACKs via a site on PKC distinct from the substrate binding site. We suggest that binding to RACKs may play a role in activation-induced translocation of PKC.

In neurodegenerative diseases, debris of dead neurons are thought to trigger glia-mediated neuroinflammation, thus increasing neuronal death. Here we show that the expression of neurotoxic proteins associated with these diseases in microglia alone is sufficient to directly trigger death of naive neurons and to propagate neuronal death through activation of naive astrocytes to the A1 state. Injury propagation is mediated, in great part, by the release of fragmented and dysfunctional microglial mitochondria into the neuronal milieu. The amount of damaged mitochondria released from microglia relative to functional mitochondria and the consequent neuronal injury are determined by Fis1-mediated mitochondrial fragmentation within the glial cells. The propagation of the inflammatory response and neuronal cell death by extracellular dysfunctional mitochondria suggests a potential new intervention for neurodegeneration-one that inhibits mitochondrial fragmentation in microglia, thus inhibiting the release of dysfunctional mitochondria into the extracellular milieu of the brain, without affecting the release of healthy neuroprotective mitochondria.

Excessive mitochondrial fission is associated with the pathology of a number of neurodegenerative diseases. Therefore, inhibitors of aberrant mitochondrial fission could provide important research tools as well as potential leads for drug development. Using a rational approach, we designed a novel and selective peptide inhibitor, P110, of excessive mitochondrial fission. P110 inhibits Drp1 enzyme activity and blocks Drp1/Fis1 interaction in vitro and in cultured neurons whereas it has no effect on the interaction between Drp1 and other mitochondrial adaptors, as demonstrated by co-immunoprecipitation. Further, using a model of Parkinson's disease (PD) in culture, we demonstrated that P110 is neuroprotective by inhibiting mitochondrial fragmentation and ROS production and subsequently improving mitochondrial membrane potential and mitochondrial integrity. P110 increased neuronal cell viability by reducing apoptosis and autophagic cell death, and reduced neurite loss of primary dopaminergic neurons in this PD cell culture model. We also found that P110 treatment appears to have minimal effects on mitochondrial fission and cell viability under basal conditions. Finally, P110 required the presence of Drp1 to inhibit mitochondrial fission under oxidative stress conditions. Together, our findings suggest that P110, as a selective peptide inhibitor of Drp1, might be useful for treatment of diseases in which excessive mitochondrial fission and mitochondrial dysfunction occur.

Protein kinase C activation is thought to protect cardiac tissue from subsequent ischemic injury by a process termed preconditioning. The protein kinase C isozyme that mediates preconditioning has not yet been identified. Using a cell culture model of hypoxic preconditioning, we found that cardiac myocyte viability after 9 h of hypoxia was increased by more than 50% over control. Preconditioning activated protein kinase C isozymes as evidenced by translocation from one cell compartment to another as follows: there was a 2.1-fold increase in ε-protein kinase C activation, a 2.8-fold increase in δ-protein kinase C activation, and no increase in βI-protein kinase C activation. 4β-Phorbol 12-myristate 13-acetate mimicked hypoxic preconditioning, increasing myocyte survival after prolonged hypoxia by 34% compared with control. We previously identified an ε-protein kinase C-selective antagonist, εV1-2 peptide, that inhibits ε-protein kinase C translocation and function in cardiac myocytes (Johnson, J. A., Gray, M. O., Chen, C.-H., and Mochly-Rosen, D. (1996) J. Biol. Chem. 271, 24962–24966). εV1-2 peptide abolished hypoxic preconditioning and phorbol ester-mediated cardiac protection. Therefore, preconditioning can be induced in this culture model, and activation of ε-protein kinase C is critical for cardiac myocyte protection. Protein kinase C activation is thought to protect cardiac tissue from subsequent ischemic injury by a process termed preconditioning. The protein kinase C isozyme that mediates preconditioning has not yet been identified. Using a cell culture model of hypoxic preconditioning, we found that cardiac myocyte viability after 9 h of hypoxia was increased by more than 50% over control. Preconditioning activated protein kinase C isozymes as evidenced by translocation from one cell compartment to another as follows: there was a 2.1-fold increase in ε-protein kinase C activation, a 2.8-fold increase in δ-protein kinase C activation, and no increase in βI-protein kinase C activation. 4β-Phorbol 12-myristate 13-acetate mimicked hypoxic preconditioning, increasing myocyte survival after prolonged hypoxia by 34% compared with control. We previously identified an ε-protein kinase C-selective antagonist, εV1-2 peptide, that inhibits ε-protein kinase C translocation and function in cardiac myocytes (Johnson, J. A., Gray, M. O., Chen, C.-H., and Mochly-Rosen, D. (1996) J. Biol. Chem. 271, 24962–24966). εV1-2 peptide abolished hypoxic preconditioning and phorbol ester-mediated cardiac protection. Therefore, preconditioning can be induced in this culture model, and activation of ε-protein kinase C is critical for cardiac myocyte protection. Identification of novel therapeutic targets for the prevention of ischemia-induced cardiac injury has been an area of intense investigation for the past 10 years. First described in a canine heart model (1Murry C.E. Jennings R.B. Reimer K.A. Circulation. 1986; 74: 1124-1136Crossref PubMed Scopus (7040) Google Scholar), preconditioning of cardiac tissue with one or more brief episodes of ischemia remains one of the most potent experimental means of reducing irreversible tissue injury during subsequent prolonged ischemia. However, the cellular and molecular mechanisms underlying this protective phenomenon remain obscure. Numerous molecules such as adenosine, α1-agonists, angiotensin II, bradykinin, and opioids have been invoked as potential mediators of ischemic preconditioning in whole heart models (2Liu Y. Gao W.D. O'Rourke B. Marban E. Circ. Res. 1996; 78: 443-454Crossref PubMed Scopus (171) Google Scholar, 3Hu K. Nattel S. Circulation. 1995; 92: 2259-2265Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 4Liu Y. Tsuchida A. Cohen M.V. Downey J.M. J. Mol. Cell. Cardiol. 1995; 27: 883-892Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar, 5Brew E.C. Mitchell M.B. Rehring T.F. Gamboni-Robertson F. McIntyre Jr., R.C. Harken A.H. Banerjee A. Am. J. Physiol. 1995; 269: H1370-H1378PubMed Google Scholar, 6Schultz J.E.J. Hsu A.K. Gross G.J. Circ. Res. 1996; 78: 1100-1104Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar). Although the exogenous mediators of preconditioning have not been definitively identified, there is substantial experimental evidence that one of the major intracellular signal transduction pathways underlying cardiac protection involves activation of protein kinase C (PKC). 1The abbreviations used are: PKC, protein kinase C; LDH, lactate dehydrogenase; PMA, 4β-phorbol 12-myristate 13-acetate. At least six different PKC isozymes have been identified in rat cardiac myocytes (7Rybin V.O. Steinberg S.F. Circ. Res. 1994; 74: 299-309Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar,8Disatnik M.-H. Buraggi G. Mochly-Rosen D. Exp. Cell Res. 1994; 210: 287-297Crossref PubMed Scopus (313) Google Scholar), where PKC regulates a number of functions such as force of contraction (9Capogrossi M.C. Kaku T. Filbarn C.R. Pelto D.J. Hansford R.G. Spurgeon H.A. Lakatta E.G. Circ. Res. 1990; 66: 1143-1155Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar), atrial natriuretic factor secretion (10Irons C.E. Sei C.A. Hidaka H. Glembotski C.C. J. Biol. Chem. 1992; 267: 5211-5216Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), and gene expression (11Kariya K. Karns L.R. Simpson P.C. J. Biol. Chem. 1991; 266: 10023-10026Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Individual isozymes translocate to characteristic intracellular sites following activation (12Disatnik M.-H. Jones S. Mochly-Rosen D. J. Mol. Cell. Cardiol. 1995; 27: 2473-2481Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (39) Google Scholar, 13Henry P. Demolombe S. Pucéat M. Escande D. Circ. Res. 1996; 78: 161-165Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar) with each isozyme playing a different role in myocyte function (14Johnson J.A. Mochly-Rosen D. Circ. Res. 1995; 76: 654-663Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 15Jiang T. Pak E. Zhang H. Kline R.P. Steinberg S.F. Circ. Res. 1996; 78: 724-736Crossref PubMed Scopus (58) Google Scholar). Activation of PKC correlates closely with the cardiac protection mediated by ischemic preconditioning in rat whole heart models. For example, PKC stimulation with dioctanoylglycerol protected adult rat heart during 45 min of regional ischemia, whereas PKC inhibition with chelerythrine abolished protection mediated by ischemic preconditioning (16Speechly-Dick M.E. Mocanu M.M. Yellon D.M. Circ. Res. 1994; 75: 586-590Crossref PubMed Scopus (354) Google Scholar). In addition, activation of PKC by transient ischemia or α1-agonists in an isolated rat heart model induced protection against global ischemia/reperfusion injury that was inhibited by PKC antagonists (17Mitchell M.B. Meng X. Ao L. Brown J.M. Harken A.H. Banerjee A. Circ. Res. 1995; 76: 73-81Crossref PubMed Google Scholar). Studies of ischemic preconditioning in whole heart models have been limited by technical issues such as the relatively low specificity of available antagonists for PKC versus other kinases, the inability of agonists and antagonists to discriminate among multiple PKC isozymes, and the difficulty of examining signal transduction mechanisms at the level of the individual cell. Cardiac myocyte culture models may provide complementary approaches to the investigation of signal transduction in preconditioning. In one such culture model, a 25-min exposure to hypoxia followed by reoxygenation protected cardiac myocytes against membrane damage for up to 6 h of severe hypoxia, and pretreatment of cells with phorbol ester mimicked the protective effects of hypoxic preconditioning (18Webster K.A. Discher D.J. Bishopric N.H. J. Mol. Cell. Cardiol. 1995; 27: 453-458Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (69) Google Scholar). In this study, we identified two hypoxic preconditioning protocols that substantially improved the viability of cultured neonatal rat cardiac myocytes following several hours of profound hypoxia. We found that both protocols induced a selective activation of PKC isozymes as evidenced by translocation and that direct activation of PKC with a phorbol ester mimicked the protective effect of hypoxic preconditioning. Moreover, we used a novel 8-amino acid antagonist of εPKC, εV1-2 peptide, to identify the isozyme that mediates this protective effect. We previously proposed the use in general of such isozyme-selective peptide inhibitors of PKC translocation and function (19Mochly-Rosen D. Science. 1995; 268: 247-251Crossref PubMed Scopus (834) Google Scholar). εV1-2 peptide is derived from the first unique region (V1) of εPKC (amino acids 14–21), and its action as a selective antagonist of εPKC translocation and function in cardiac myocytes has been characterized in detail (20Johnson J.A. Gray M.O. Chen C.-H. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1996; 271: 24962-24966Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (343) Google Scholar). Introduction of this peptide into myocytes selectively inhibited PMA-induced translocation of εPKC but not the translocation of other PKC isozymes (20Johnson J.A. Gray M.O. Chen C.-H. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1996; 271: 24962-24966Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (343) Google Scholar). Furthermore, there was a selective loss of regulation of contraction rate in the presence of εV1-2 that was not seen with βC2-4, a translocation inhibitor selective for the cPKC isozymes (20Johnson J.A. Gray M.O. Chen C.-H. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1996; 271: 24962-24966Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (343) Google Scholar, 21Ron D. Luo J. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24180-24187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (278) Google Scholar). Using εV1-2 in a different cell culture model, we also showed that εPKC mediates, at least in part, glucose-induced insulin secretion in pancreatic cells (22Yedovitzky M. Mochly-Rosen D. Johnson J.A. Gray M.O. Ron D. Abramovitch E. Cerasi E. Nesher R. J. Biol. Chem. 1997; 272: 1417-1420Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (164) Google Scholar). In the present study, we introduced εV1-2 peptide into cardiac myocytes and showed for the first time that isozyme-selective inhibition of εPKC translocation and function inhibited the protective effect of preconditioning. These data indicate a major role for the εPKC isozyme in cardiac myocyte protection by hypoxic preconditioning. Primary cultures were prepared as described previously (23Simpson P. McGrath A. Savion S. Circ. Res. 1982; 51: 787-801Crossref PubMed Scopus (373) Google Scholar). After removal of non-myocytes in a preplating step, isolated myocytes (90–95% of the cells) were seeded at 800 cells per mm2 into 8-well glass chamber slides (Nunc) for cell viability assays and immunofluorescence staining, into 6-well plastic culture plates (Fisher) for lactate dehydrogenase (LDH) assays, or into 100-mm glass culture dishes for Western blot analysis. On culture day 4, myocytes were placed in defined medium (23Simpson P. McGrath A. Savion S. Circ. Res. 1982; 51: 787-801Crossref PubMed Scopus (373) Google Scholar) then fed with fresh defined medium on the evening prior to treatment (days 6–8). For hypoxic preconditioning and prolonged hypoxic challenges, myocytes were transferred into and out of a plexiglass glove box (Anaerobic Systems) maintained at 37 °C with a humidified atmosphere of 1% CO2, less than 0.5% O2, and the balance N2. Monitoring with a Fyrite Gas Analyzer (United Technologies) verified O2concentrations between 0.2 and 0.5%. Lysis of samples for Western blot analyses and fixation of myocytes for immunofluorescence staining were performed without reoxygenation. Normoxic incubations of myocytes were conducted in a water-jacketed incubator (Forma Scientific) gassed with 99% air and 1% CO2 at 37 °C. Hypoxic preconditioning initially consisted of four 90-min periods of hypoxia alternating with 60-min normoxic incubations. Myocytes were kept in 5 mm glucose defined medium throughout the protocol. For subsequent single cycle preconditioning experiments, myocytes were fed pre-equilibrated, glucose-free defined medium within the hypoxia chamber for 30 min. For phorbol ester preconditioning experiments, myocytes were stimulated with 10 nm PMA for 10 min then washed with fresh 5 mm glucose defined medium. We previously reported that 2 h of hypoxia resulted in a medium pO2 of 23.9 ± 1.5 torr, pH of 7.34 ± 0.02, and pCO2 of 46.6 ± 0.7 torr. LDH release from glucose-supplemented myocytes subjected to 2 h of hypoxia and from glucose-deprived myocytes subjected to 30 or 60 min of hypoxia was no different from normoxic control cells (24Rocha-Singh K.J. Honbo N.Y. Karliner J.S. J. Clin. Invest. 1991; 88: 204-213Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). These data suggested that hypoxic preconditioning does not cause irreversible cellular damage, an assumption that we verified using a cell viability assay (see below). In all cases, myocytes were subjected to a prolonged hypoxic challenge by transfer into the plexiglass chamber followed by feeding with glucose-free defined medium pre-equilibrated for several hours within the hypoxic environment. Cells were removed 7–9 h later and immediately underwent the indicated analysis. Western blot analysis was carried out as described previously in our laboratory (14Johnson J.A. Mochly-Rosen D. Circ. Res. 1995; 76: 654-663Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar) using monoclonal anti-αPKC and anti-βPKC antibodies (Seikagaku) diluted 1:1000 and then rabbit anti-mouse IgG antibodies (Cappel) at 1:1000 dilution or using rabbit polyclonal anti-δPKC and anti-εPKC antibodies (Life Technologies, Inc.) at 1:300 dilution, followed by125I-protein A (ICN) and detection of PKC immunoreactive bands by autoradiography. Following treatment of myocytes grown on chamber slides, living and dead cells were distinguished using the EukolightTM Viability/Cytotoxicity assay (Molecular Probes). Culture medium was replaced with 2 μm calcein acetoxymethyl ester and 4 μm ethidium homodimer-1. Slides were viewed with a Zeiss IM35 microscope using a 40 × water immersion objective. Viable (green fluorescent by calcein) and non-viable (red fluorescent by ethidium) myocytes present in 10–20 random microscopic fields per condition per experiment were recorded. Immunofluorescence staining was carried out using identical antibodies as described previously (8Disatnik M.-H. Buraggi G. Mochly-Rosen D. Exp. Cell Res. 1994; 210: 287-297Crossref PubMed Scopus (313) Google Scholar, 20Johnson J.A. Gray M.O. Chen C.-H. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1996; 271: 24962-24966Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (343) Google Scholar). Isozyme-specific rabbit polyclonal antibodies (R & D Antibodies) directed against βIPKC, δPKC, or εPKC were used at 1:100 dilution followed by fluorescein isothiocyanate-conjugated goat anti-rabbit IgG antibodies (Cappel) diluted 1:1000 and were viewed with a Zeiss IM35 microscope using a 40 × water immersion objective. Images were recorded on Kodak TMAX 400 film with exposure time of 1 s for all photomicrographs and were processed by an automated, commercial developer without additional adjustment. The specificity of the immunostaining technique used to detect εPKC in the present study has been confirmed previously. First, pre-absorption of primary antibody with the immunizing peptide (8Disatnik M.-H. Buraggi G. Mochly-Rosen D. Exp. Cell Res. 1994; 210: 287-297Crossref PubMed Scopus (313) Google Scholar) or with the corresponding recombinant PKC expressed in Sf9 cells (20Johnson J.A. Gray M.O. Chen C.-H. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1996; 271: 24962-24966Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (343) Google Scholar) abolished specific staining (see also Fig. 3 C). Second, there was a direct correlation between translocation of εPKC measured by Western blot analysis and that measured by immunofluoresence staining (14Johnson J.A. Mochly-Rosen D. Circ. Res. 1995; 76: 654-663Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 20Johnson J.A. Gray M.O. Chen C.-H. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1996; 271: 24962-24966Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (343) Google Scholar, 21Ron D. Luo J. Mochly-Rosen D. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24180-24187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (278) Google Scholar). Finally, the immunostaining pattern seen with commercial antibody was identical to that found using monoclonal antibody (CK 1.4) to εPKC (25Mochly-Rosen D. Henrich C.J. Cheever L. Khaner H. Simpson P.C. Mol. Biol. Cell. 1990; 1: 693-706Crossref Scopus (224) Google Scholar). The effect of hypoxia on LDH release from cardiac myocytes was assessed as described previously (24Rocha-Singh K.J. Honbo N.Y. Karliner J.S. J. Clin. Invest. 1991; 88: 204-213Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Following each treatment, culture media were stored at 4 °C. An equal volume of cold lysing buffer (10 mm Tris-HCl, pH 7.4, and 1 mm EDTA) was added to each well, and lysates were centrifuged at 4 °C for 15 min at 50,000 × g. Aliquots from culture media samples (released LDH) and from supernatants of cell lysates (retained LDH) were analyzed using an assay in which the rate of decrease in absorbance of the sample at 340 nm is directly proportional to LDH activity (Sigma). LDH activity was expressed as units per liter, where 1 unit is defined as the amount of enzyme catalyzing the formation of 1 μmol/liter NAD per min under the conditions of the assay. Transient permeabilization of cardiac myocytes was carried out exactly as described previously using buffer containing saponin (50 μg/ml) and ATP (6 mm) at 4 °C (26Johnson J.A. Gray M.O. Karliner J.S. Mochly-Rosen D. Circ. Res. 1996; 79: 1086-1099Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar). Permeabilization carried out according to this protocol did not alter myocyte viability, spontaneous or stimulated contraction rates, basal or hormone-induced expression of c-fos mRNA, or growth factor-induced hypertrophy (26Johnson J.A. Gray M.O. Karliner J.S. Mochly-Rosen D. Circ. Res. 1996; 79: 1086-1099Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar). All peptides used in this study, εV1-2 (EAVSLKPT, εPKC-(14–21)), εV1-3 (LAVFHDA, εPKC-(81–87)), and βC2-4 (SLNPEWNET, βPKC-(218–226)), were synthesized at the Beckman Center Protein and Nucleic Acid Facility at Stanford University and more than 95% pure. Phorbol esters were purchased from LC Laboratories. Monoclonal anti-human Hsp70 antibody was purchased from StressGen Biotechnologies. All other reagents were from Sigma. All data were expressed as mean ± S.E. Numerical data were compared using Student's t test for paired observations between two groups and by analysis of variance followed by the Bonferroni t test when more than two groups were analyzed. A p value of <0.05 was considered significant. Our original preconditioning paradigm consisted of four 90-min periods of hypoxia alternating with 60-min normoxic incubations. The hypoxic period was based on our observation that myocytes incubated in glucose-supplemented medium tolerated up to 2 h of hypoxia without reduction of viability (24Rocha-Singh K.J. Honbo N.Y. Karliner J.S. J. Clin. Invest. 1991; 88: 204-213Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). The number of cycles was based on the study of preconditioning in canine myocardium in which four brief coronary artery occlusions protected cardiac tissue from prolonged ischemia (1Murry C.E. Jennings R.B. Reimer K.A. Circulation. 1986; 74: 1124-1136Crossref PubMed Scopus (7040) Google Scholar). The protective effect of our protocol was determined using an assay that discriminated between living and dead myocytes upon completion of a prolonged hypoxic challenge. This method has been validated with a variety of adherent cell types (27Hauser J.M.L. Buehrer B.M. Bell R.M. J. Biol. Chem. 1994; 269: 6803-6809Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) as well as with primary cultures of neonatal rat cardiac myocytes (28Kirshenbaum L.A. Schneider M.D. J. Biol. Chem. 1995; 270: 7791-7794Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (139) Google Scholar). The proportion of viable (green fluorescent) cardiac myocytes under normoxic conditions was consistently greater than 95% (Fig. 1 A). Following transfer, non-viable (red fluorescent) cardiac myocytes exceeded 50% after 7–9 h of exposure to the hypoxic environment (Fig.1 B). In two independent experiments, 20 random microscopic fields per condition (600 cells each) were scored just after the final preconditioning cycle. The proportion of viable cells in the preconditioned group was no different from that of normoxic control cells (96.5 ± 0.7 versus 97.2 ± 0.8%). Therefore, hypoxic preconditioning had no immediate effect on myocyte survival. In contrast, hypoxic preconditioning had a profound effect on expression of the inducible 72-kDa member of the heat shock protein 70-kDa family (Hsp70). In control myocytes Hsp70 was barely detectable by Western blot analysis, whereas preconditioning up-regulated the expression of Hsp70 by severalfold (Fig.2 A). Others (29Marber M.S. Mestril R. Chi S.-H. Sayen M.R. Yellon D.M. Dillmann W.H. J. Clin. Invest. 1995; 95: 1446-1456Crossref PubMed Scopus (767) Google Scholar) have reported that overexpression of rat Hsp70 improved contractile function and reduced the zone of infarction following 20 min of zero-flow ischemia in hearts harvested from transgene-positive mice compared with hearts from transgene-negative littermates. Also, specific induction of Hsp70 in cultured neonatal rat cardiac myocytes by the tyrosine kinase inhibitor herbimycin-A increased cell survival during subsequent lethal heat stress and simulated ischemia (30Morris S.D. Cumming D.V.E. Latchman D.S. Yellon D.M. J. Clin. Invest. 1996; 97: 706-712Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). We found that preconditioning increased the proportion of surviving myocytes by 52% compared with control (66.5 ± 1.4 versus 43.7 ± 3.3%) following 9 h of hypoxia (Fig. 2 B). Therefore, we have identified a cardiac myocyte culture model for hypoxic preconditioning. We first determined whether hypoxic preconditioning activated PKC using an immunofluorescence assay in which myocytes were stained with isozyme-specific anti-PKC antibodies. Activated PKC isozymes translocate to distinct, characteristic subcellular locations; εPKC translocates from the nucleus to perinuclear, cell-cell contact, and cross-striated structures. δPKC translocates from the nucleus to perinuclear structures. βIPKC translocates from the cytosol into the nucleus (8Disatnik M.-H. Buraggi G. Mochly-Rosen D. Exp. Cell Res. 1994; 210: 287-297Crossref PubMed Scopus (313) Google Scholar). Individual myocytes can then be scored as basal or activated, and the proportions of each were compared with those of cell populations stimulated with known activators of PKC such as norepinephrine. This immunofluorescence technique is extremely sensitive in demonstrating translocation because it does not disrupt cell structure and because dissociation from the translocation site does not occur in cells fixed immediately after treatment. We found that hypoxic preconditioning produced a 2.1-fold increase in εPKC activation (49.9 ± 2.8 versus 23.6 ± 2.6% for control) and a 2.8-fold increase in δPKC activation (58.4 ± 2.9versus 20.7 ± 2.8% for control), an effect comparable to that induced by stimulation with 2 μm norepinephrine under normoxic conditions. No activation of βIPKC by hypoxic preconditioning was observed (Fig.3). Therefore, hypoxic preconditioning selectively activated δ- and εPKC isozymes in cultured cardiac myocytes. A recent study using a similar myocyte culture model reported redistribution of εPKC in response to hypoxia using Western blot analysis (31Goldberg M. Zhang H.L. Steinberg S.F. J. Clin. Invest. 1997; 99: 55-61Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar), thereby providing independent corroboration of our observations. We also determined whether direct activation of PKC with phorbol ester could protect cardiac myocytes from hypoxic damage. We stimulated myocytes with 10 nm PMA for 10 min since this concentration and incubation period induced a robust, selective activation of δ- and εPKC by Western blot analysis (Fig.4). As we previously reported, there was no activation of αPKC and minimal activation of βPKC using <10 nm PMA (14Johnson J.A. Mochly-Rosen D. Circ. Res. 1995; 76: 654-663Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar). In contrast, where activation of these isozymes has been observed, the concentration of PMA used was 100 nm to 1 μm (7Rybin V.O. Steinberg S.F. Circ. Res. 1994; 74: 299-309Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 32Puceat M. Hilal-Dandan R. Strulovici B. Brunton L.L. Brown J.H. J. Biol. Chem. 1994; 269: 16938-16944Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 33Clerk A. Bogoyevitch M.A. Fuller S.J. Lazou A. Parker P.J. Sugden P. Am. J. Physiol. 1995; 269: H1087-H1097PubMed Google Scholar). This pattern of PKC activation by 10 nm PMA was comparable to that observed with hypoxic preconditioning as determined by immunofluorescence staining (Fig. 3). Furthermore, PMA-mediated preconditioning protected cardiac myocytes, increasing the proportion of surviving myocytes by 34% compared with control (59.3 ± 1.9 versus44.1 ± 2.1%) following 9 h of hypoxia (Fig.5 A). PMA-mediated preconditioning was also protective during prolonged hypoxia by an independent assay of cell viability and retained LDH activity. Under normoxic conditions PMA had no effect on retained LDH activity (data not shown). However, PMA increased retained LDH activity by 42% compared with control (387 ± 18 units/liter versus274 ± 24 units/liter in four independent experiments,p < 0.05) following 9 h of hypoxia. Therefore, PMA treatment of myocytes in culture mimicked hypoxic preconditioning.Figure 5Activation of εPKC is required for PMA- and hypoxic preconditioning-induced protection of cardiac myocytes from subsequent prolonged hypoxia. A, myocytes were permeabilized to introduce a peptide inhibitor of εPKC (εV1-2), control peptide (εV1-3), or no peptide (–). Cells were then stimulated with 10 nm for 10 min (Phorbol Ester) or vehicle (Control), washed, and subjected to 9 h of hypoxia. 10 random fields per condition in each of four independent experiments were scored for cell viability. Preconditioning increased the proportion of surviving myocytes by 34% versus control. Protection was abolished by the εPKC-selective antagonist εV1-2. The number in each bar represents the total number of cells scored per condition. †, p < 0.05versus control cells. *, p < 0.05versus PMA-treated cells permeabilized in the absence of peptide (−) or in the presence of εPKC-derived control peptide (εV1-3). B, myocytes were permeabilized to introduce εV1-2, control (βC2-4), or no peptide (–) and then exposed to 30 min of hypoxia in the absence of glucose (Preconditioned). After 30 min of recovery under normoxic conditions, preconditioned and control cells were subjected to 9 h of hypoxia. 20 random fields in each of two independent experiments were scored for cell viability. Preconditioning increased the proportion of surviving cells by 86%versus control. Protection was abolished by εV1-2. Thenumber in each bar represents the total number of cells scored per condition. ††, p < 0.05versus control cells. **, p < 0.05versus preconditioned cells permeabilized in the absence of peptide (–) or in the presence of control peptide (βC2-4).C, left, myocytes were either maintained in glucose-supplemented medium under normoxic conditions (Nx) or incubated in glucose-free medium under hypoxic conditions (Hypoxia) for the times indicated. Western blot analysis revealed translocation of εPKC from the soluble to the particulate fraction following 30–120 min of hypoxia. Result is representative of two independent experiments. Densitometry revealed a 70% reduction in signal intensity at 120 min compared with normoxia in the soluble fraction and a 42% increase in the particulate fraction. C, right, myocytes were permeabilized in the presence of εV1-2 (+) or in the absence of peptide (−) and then either incubated under normoxic conditions (Nx) or exposed to 1 h of hypoxia (Hx) in glucose-free medium. Hypoxia induced translocation of εPKC from the soluble to the particulate fraction that was inhibited by the εPKC-selective peptide antagonist. Result is representative of two independent experiments. By densitometry, hypoxia caused reductions of 40 and 45%, respectively, in signal intensity in the second and third lanes of the soluble fraction compared with normoxia. The corresponding increase in the particulate fraction in the second lane was 47%, which was reduced by εV1-2 to less than half (21% increase).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) In many cell types, activation of PKC isozymes is associated with translocation from the cell soluble to the cell particulate fraction (34Kraft A.S. Anderson W.B. Nature. 1983; 301: 621-623Crossref PubMed Scopus (1002) Google Scholar). In addition to binding to lipids, activated PKC isozymes bind to specific anchoring proteins within the particulate fraction termed RACKs, for receptors for activated protein kinase C (35Mochly-Rosen D. Khaner H. Lopez J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 3997-4000Crossref PubMed Scopus (441) Google Scholar). If stimulation-induced translocation of a PKC isozyme to its appropriate intracellular target is required for its function, then peptides that compete for binding of activated PKC isozymes to their RACKs should act as isozyme-selective inhibitors of PKC translocation and function. For example, a 9-amino acid peptide derived from the second common region (C2) of βPKC, termed βC2-4 (SLNPEWNET, βPKC-(218–226)), selectively inhibited insulin-induced βPKC trans

Protein kinase C (PKC) isozymes translocate to unique subcellular sites following activation. We previously suggested that translocation of activated isozymes is required for their function and that in addition to binding to lipids, translocation involves binding of the activated isozymes to specific anchoring proteins (receptors for activated protein kinase C. Using cultured cardiomyocytes we identified inhibitors, the V1 fragment of ϵPKC (ϵV1), and an 8-amino acid peptide derived from it that selectively inhibited the translocation of ϵPKC. Inhibition of ϵPKC translocation but not inhibition of δ or βPKC translocation specifically blocked phorbol ester- or norepinephrine-mediated regulation of contraction. These isozyme-selective translocation inhibitors provide novel tools to determine the function of individual PKC isozymes in intact cells. Protein kinase C (PKC) isozymes translocate to unique subcellular sites following activation. We previously suggested that translocation of activated isozymes is required for their function and that in addition to binding to lipids, translocation involves binding of the activated isozymes to specific anchoring proteins (receptors for activated protein kinase C. Using cultured cardiomyocytes we identified inhibitors, the V1 fragment of ϵPKC (ϵV1), and an 8-amino acid peptide derived from it that selectively inhibited the translocation of ϵPKC. Inhibition of ϵPKC translocation but not inhibition of δ or βPKC translocation specifically blocked phorbol ester- or norepinephrine-mediated regulation of contraction. These isozyme-selective translocation inhibitors provide novel tools to determine the function of individual PKC isozymes in intact cells.

Recent advances highlight a pivotal role for cellular metabolism in programming immune responses. Here, we demonstrate that cell-autonomous generation of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) via the kynurenine pathway (KP) regulates macrophage immune function in aging and inflammation. Isotope tracer studies revealed that macrophage NAD+ derives substantially from KP metabolism of tryptophan. Genetic or pharmacological blockade of de novo NAD+ synthesis depleted NAD+, suppressed mitochondrial NAD+-dependent signaling and respiration, and impaired phagocytosis and resolution of inflammation. Innate immune challenge triggered upstream KP activation but paradoxically suppressed cell-autonomous NAD+ synthesis by limiting the conversion of downstream quinolinate to NAD+, a profile recapitulated in aging macrophages. Increasing de novo NAD+ generation in immune-challenged or aged macrophages restored oxidative phosphorylation and homeostatic immune responses. Thus, KP-derived NAD+ operates as a metabolic switch to specify macrophage effector responses. Breakdown of de novo NAD+ synthesis may underlie declining NAD+ levels and rising innate immune dysfunction in aging and age-associated diseases. Macrophages alter their metabolism in response to infection. The authors show that resting macrophages generate nicotinamide adenine dinucleotide via de novo synthesis, but activated and aged cells suppress the rate-limiting enzyme quinolinate phosphoribosyltransferase to regulate mitochondrial and immunological functions.