Abstract Cell plasticity sustains intra-tumor heterogeneity and treatment resistance in melanoma. Deciphering the transcriptional mechanisms governing reversible phenotypic transitions between proliferative/differentiated and invasive/stem-like states is required in order to design novel therapeutic strategies. EMT-inducing transcription factors, extensively known for their role in metastasis in carcinoma, display cell-type specific functions in melanoma, with a decreased ZEB2/ZEB1 expression ratio fostering adaptive resistance to targeted therapies. While ZEB1 direct target genes have been well characterized in carcinoma models, they remain unknown in melanoma. Here, we performed a genome-wide characterization of ZEB1 transcriptional targets, by combining ChIP-sequencing and RNA-sequencing, upon phenotype switching in melanoma models. We identified and validated ZEB1 binding peaks in the promoter of key lineage-specific genes related to melanoma cell identity. Comparative analyses with breast carcinoma cells demonstrated melanoma-specific ZEB1 binding, further supporting lineage specificity. Gain- or loss-of-function of ZEB1, combined with functional analyses, further demonstrated that ZEB1 negatively regulates proliferative/melanocytic programs and positively regulates both invasive and stem-like programs. We then developed single-cell spatial multiplexed analyses to characterize melanoma cell states with respect to ZEB1/ZEB2 expression in human melanoma samples. We characterized the intra-tumoral heterogeneity of ZEB1 and ZEB2 and further validated ZEB1 increased expression in invasive cells, but also in stem-like cells, highlighting its relevance in vivo in both populations. Overall, our results define ZEB1 as a major transcriptional regulator of cell states transitions and provide a better understanding of lineage-specific transcriptional programs sustaining intra-tumor heterogeneity in melanoma. statement of significance We identify a ZEB1-driven, lineage-specific transcriptional program governing cell states transitions in melanoma, driving the emergence of invasive and stem-like states, and demonstrate its relevance in sustaining intra-tumor heterogeneity in human samples.

Summary While uncommon in breast cancers, oncogenic activation of the RAS/MAPK signalling pathway is frequent in claudin-low (CL) tumours, a subtype of breast malignancies enriched in features of epithelial-mesenchymal transition (EMT), suggesting an interplay between RAS activation and EMT. Using inducible models of human mammary epithelial cells, we show that RAS-mediated transformation relies on cellular reprogramming governed by the EMT-inducing transcription factor ZEB1. The path to ZEB1 induction involves a paracrine process: cells entering a senescent state following RAS activation release proinflammatory cytokines, notably IL-6 and IL-1α which promote ZEB1 expression and activity in neighbouring cells, thereby fostering their malignant transformation. Collectively, our findings unveil a previously unprecedented role for senescence in bridging RAS activation and EMT over the course of malignant transformation of human mammary epithelial cells.

Abstract Breast cancer is one of the most prominent types of cancers, in which therapeutic resistance is still a major clinical hurdle. Specific subtypes like Claudin-low (CL) and metaplastic breast cancers (MpBC) have been associated with high non-genetic plasticity, which can facilitate resistance. The overlaps and differences between these orthogonal subtypes, respectively identified by molecular and histopathological analyses, are however still insufficiently characterised. Adequate methods to identify high-plasticity tumours to better anticipate resistance are furthermore still lacking. Here we analysed 11 triple negative breast tumours, including 3 CL and 4 MpBC samples, via high-resolution spatial transcriptomics. We combined pathological annotations and deconvolution approaches to precisely identify tumour spots, on which we performed signature enrichment, differential expression and copy-number analyses. We used the TCGA and CCLE public databases for external validation of expression markers. By levying spatial transcriptomics to focus analyses only to tumour cells in MpBC samples, and therefore bypassing the negative impact of stromal contamination, we could identify specific markers that are not expressed in other subtypes nor stromal cells. Three markers ( BMPER, POPDC3 and SH3RF3 ) could furthermore be validated in external expression databases encompassing bulk tumour material and stroma-free cell lines. We find that existing bulk expression signatures of high-plasticity breast cancers are relevant in mesenchymal transdifferentiated compartments but can be hindered by stromal cell prevalence in tumour samples, negatively impacting their clinical applicability. Spatial transcriptomics analyses can however help identify more specific expression markers, and could thus enhance diagnosis and clinical care of rare high-plasticity breast cancers.

Epithelial–mesenchymal transition (EMT) involves profound changes in cell morphology, driven by transcriptional and epigenetic reprogramming. However, evidence suggests that translation and ribosome composition also play key roles in establishing pathophysiological phenotypes. Using genome-wide analyses, we reported significant rearrangement of the translational landscape and machinery during EMT. Specifically, a cell line overexpressing the EMT transcription factor ZEB1 displayed alterations in translational reprogramming and fidelity. Furthermore, using riboproteomics, we unveiled an increased level of the ribosomal protein RPL36A in mesenchymal ribosomes, indicating precise tuning of ribosome composition. Remarkably, RPL36A overexpression alone was sufficient to trigger the acquisition of mesenchymal features, including a switch in the molecular pattern, cell morphology, and behavior, demonstrating its pivotal role in EMT. These findings underline the importance of translational reprogramming and fine-tuning of ribosome composition in EMT.