ABSTRACT Animal cell lines cultured for extended periods often undergo extreme genome restructuring events, including polyploidy and segmental aneuploidy that can impede de novo whole-genome assembly (WGA). In Drosophila , many established cell lines also exhibit massive proliferation of transposable elements (TEs) relative to wild-type flies. To better understand the role of transposition during long-term animal somatic cell culture, we sequenced the genome of the tetraploid Drosophila S2R+ cell line using long-read and linked-read technologies. Relative to comparable data from inbred whole flies, WGAs for S2R+ were highly fragmented and generated variable estimates of TE content across sequencing and assembly technologies. We therefore developed a novel WGA-independent bioinformatics method called “TELR” that identifies, locally assembles, and estimates allele frequency of TEs from long-read sequence data ( https://github.com/bergmanlab/telr ). Application of TELR to a ∼130x PacBio dataset for S2R+ revealed many haplotype-specific TE insertions that arose by somatic transposition in cell culture after initial cell line establishment and subsequent tetraploidization. Local assemblies from TELR also allowed phylogenetic analysis of paralogous TE copies within the S2R+ genome, which revealed that proliferation of different TE families during cell line evolution in vitro can be driven by single or multiple source lineages. Our work provides a model for the analysis of TEs in complex heterozygous or polyploid genomes that are not amenable to WGA and yields new insights into the mechanisms of genome evolution in animal cell culture.

ABSTRACT Cultured cells are widely used in molecular biology despite poor understanding of how cell line genomes change in vitro over time. Previous work has shown that Drosophila cultured cells have a higher transposable element (TE) content than whole flies, but whether this increase in TE content resulted from an initial burst of transposition during cell line establishment or ongoing transposition in cell culture remains unclear. Here we sequence the genomes of 25 sub-lines of Drosophila S2 cells and show that TE insertions provide abundant markers for the phylogenetic reconstruction of diverse sub-lines in a model animal cell culture system. Analysis of DNA copy number evolution across S2 sub-lines revealed dramatically different patterns of genome organization that support the overall evolutionary history reconstructed using TE insertions. Analysis of TE insertion site occupancy and ancestral states support a model of ongoing transposition dominated by episodic activity of a small number of retrotransposon families. Our work demonstrates that substantial genome evolution occurs during long-term Drosophila cell culture, which may impact the reproducibility of experiments that do not control for sub-line identity.

Many computational methods have been developed to detect non-reference transposable element (TE) insertions using short-read whole genome sequencing data. The diversity and complexity of such methods often present challenges to new users seeking to reproducibly install, execute, or evaluate multiple TE insertion detectors.We previously developed the McClintock meta-pipeline to facilitate the installation, execution, and evaluation of six first-generation short-read TE detectors. Here, we report a completely re-implemented version of McClintock written in Python using Snakemake and Conda that improves its installation, error handling, speed, stability, and extensibility. McClintock 2 now includes 12 short-read TE detectors, auxiliary pre-processing and analysis modules, interactive HTML reports, and a simulation framework to reproducibly evaluate the accuracy of component TE detectors. When applied to the model microbial eukaryote Saccharomyces cerevisiae, we find substantial variation in the ability of McClintock 2 components to identify the precise locations of non-reference TE insertions, with RelocaTE2 showing the highest recall and precision in simulated data. We find that RelocaTE2, TEMP, TEMP2 and TEBreak provide a consistent and biologically meaningful view of non-reference TE insertions in a species-wide panel of âˆ¼1000 yeast genomes, as evaluated by coverage-based abundance estimates and expected patterns of tRNA promoter targeting. Finally, we show that best-in-class predictors for yeast have sufficient resolution to reveal a dyad pattern of integration in nucleosome-bound regions upstream of yeast tRNA genes for Ty1, Ty2, and Ty4, allowing us to extend knowledge about fine-scale target preferences first revealed experimentally for Ty1 to natural insertions and related copia-superfamily retrotransposons in yeast.McClintock (https://github.com/bergmanlab/mcclintock/) provides a user-friendly pipeline for the identification of TEs in short-read WGS data using multiple TE detectors, which should benefit researchers studying TE insertion variation in a wide range of different organisms. Application of the improved McClintock system to simulated and empirical yeast genome data reveals best-in-class methods and novel biological insights for one of the most widely-studied model eukaryotes and provides a paradigm for evaluating and selecting non-reference TE detectors for other species.

Early identification of the risk for triple-negative breast cancer (TNBC) at the asymptomatic phase could lead to better prognosis. Here we developed a machine learning method to quantify systematic impact of all rare germline mutations on each pathway. We collected 106 TNBC patients and 287 elder healthy women controls. The spectra of activity profiles in multiple pathways were mapped and most pathway activities exhibited globally suppressed by the portfolio of individual germline mutations in TNBC patients. Accordingly, all individuals were delineated into two types: A and B. Type A patients could be differentiated from controls (AUC = 0.89) and sensitive to BRCA1/2 damages; Type B patients can be also differentiated from controls (AUC = 0.69) but probably being protected from BRCA1/2 damages. Further we found that Individuals with the lowest activity of selected pathways had extreme high relative risk (up to 21.67 in type A) and increased lymph node metastasis in these patients. Our study showed that genomic DNA contains information of unimaginable pathogenic factors. And this information is in a distributed form that could be applied to risk assessment for more cancer types. Significance: We identified individuals who are more susceptible to triple negative breast cancer. Our method performs much better than previous assessments based on BRCA1/2 damages, even polygenic risk scores. We disclosed previously unimaginable pathogens in a distributed form on genome and extended risk prediction to scenarios for other cancers.

ABSTRACT Cell culture systems allow key insights into biological mechanisms yet suffer from irreproducible outcomes in part because of cross-contamination or mislabelling of cell lines. Cell line misidentification can be mitigated by the use of genotyping protocols, which have been developed for human cell lines but are lacking for many important model species. Here we leverage the classical observation that transposable elements (TEs) proliferate in cultured Drosophila cells to demonstrate that genome-wide TE insertion profiles can reveal the identity and provenance of Drosophila cell lines. We identify multiple cases where TE profiles clarify the origin of Drosophila cell lines (Sg4, mbn2, and OSS_E) relative to published reports, and also provide evidence that insertions from only a subset of LTR retrotransposon families are necessary to mark Drosophila cell line identity. We also develop a new bioinformatics approach to detect TE insertions and estimate intra-sample allele frequencies in legacy whole-genome shotgun sequencing data (called ngs_te_mapper2), which revealed copy-neutral loss of heterozygosity as a mechanism shaping the unique TE profiles that identify Drosophila cell lines. Our work contributes to the general understanding of the forces impacting metazoan genomes as they evolve in cell culture and paves the way for high-throughput protocols that use TE insertions to authenticate cell lines in Drosophila and other organisms.

Abstract Drosophila cell lines are used by researchers to investigate various cell biological phenomena. It is crucial to exercise good cell culture practice. Poor handling can lead to both inter- and intraspecies cross-contamination. Prolonged culturing can lead to introduction of large- and small-scale genomic changes. These factors, therefore, make it imperative that methods to authenticate Drosophila cell lines are developed to ensure reproducibility. Mammalian cell line authentication is reliant on short tandem repeat (STR) profiling, however the relatively low STR mutation rate in D. melanogaster at the individual level is likely to preclude the value of this technique. In contrast, transposable elements (TE) are highly polymorphic among individual flies and abundant in Drosophila cell lines. Therefore, we investigated the utility of TE insertions as markers to discriminate Drosophila cell lines derived from the same or different donor genotypes, divergent sub-lines of the same cell line, and from other insect cell lines. We developed a PCR-based next-generation sequencing protocol to cluster cell lines based on the genome-wide distribution of a limited number of diagnostic TE families. We determined the distribution of five TE families in S2R+, S2-DRSC, S2-DGRC, Kc167, ML-DmBG3-c2, mbn2, CME W1 Cl.8+, and OSS Drosophila cell lines. Two independent downstream analyses of the NGS data yielded similar clustering of these cell lines. Double-blind testing of the protocol reliably identified various Drosophila cell lines. In addition, our data indicate minimal changes with respect to the genome-wide distribution of these five TE families when cells are passaged for at least 50 times. The protocol developed can accurately identify and distinguish the numerous Drosophila cell lines available to the research community, thereby aiding reproducible Drosophila cell culture research.