Single-cell RNA-sequencing is revolutionising our understanding of seemingly homogeneous cell populations but has not yet been widely applied to single-celled organisms. Transcriptional variation in unicellular malaria parasites from the Plasmodium genus is associated with critical phenotypes including red blood cell invasion and immune evasion, yet transcriptional variation at an individual parasite level has not been examined in depth. Here, we describe the adaptation of a single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) protocol to deconvolute transcriptional variation for more than 500 individual parasites of both rodent and human malaria comprising asexual and sexual life-cycle stages. We uncover previously hidden discrete transcriptional signatures during the pathogenic part of the life cycle, suggesting that expression over development is not as continuous as commonly thought. In transmission stages, we find novel, sex-specific roles for differential expression of contingency gene families that are usually associated with immune evasion and pathogenesis.

Abstract Single-cell RNA-sequencing is revolutionising our understanding of seemingly homogeneous cell populations, but has not yet been applied to single cell organisms. Here, we established a method to successfully investigate transcriptional variation across individual malaria parasites. We discover an unexpected, discontinuous program of transcription during asexual growth previously masked by bulk analyses, and uncover novel variation among sexual stage parasites in their expression of gene families important in host-parasite interactions.

Viruses that infect animals regularly spill over into the human population, but individual events may lead to anything from a single case to a novel pandemic. Rapidly gaining an understanding of a spillover event is critical to calibrating a public health response. We here propose a novel method, using likelihood-free rejection sampling, to evaluate the properties of an outbreak of swine-origin influenza A(H1N2)v in the United Kingdom, detected in November 2023. From the limited data available, we generate historical estimates of the probability that the outbreak had died out in the days following the detection of the first case. Our method suggests that the outbreak could have been said to be over with 95% certainty between 19 and 29 days after the first case was detected, depending upon the probability of a case being detected. We further estimate the number of undetected cases conditional upon the outbreak still being live, the epidemiological parameter R 0 , and the date on which the spillover event itself occurred. Our method requires minimal data to be effective. While our calculations were performed after the event, the real-time application of our method has potential value for public health responses to cases of emerging viral infection.

E1 and E2 (E1E2), the entry proteins of Hepatitis C Virus (HCV), are unlike that of any other virus yet described, and the detailed molecular mechanisms of HCV entry/fusion remain unknown. Hypervariable region-1 (HVR-1) of E2 is a putative intrinsically disordered protein tail. Here, we demonstrate that HVR-1 has an autoinhibitory function that suppresses the activity of E1E2 on free virions; this is dependent on its conformational entropy. Crucially, to allow entry, this mechanism is turned off by host receptor interactions at the cell surface. Thus, HVR-1 is akin to a safety catch on E1E2 activity. Mutations that reduce conformational entropy in HVR-1, or genetic deletion of HVR-1, turn off the safety catch to generate hyper-reactive HCV that exhibits enhanced virus entry but is thermally unstable and acutely sensitive to neutralising antibodies. Therefore, the HVR-1 safety catch controls the efficiency of virus entry and maintains resistance to neutralising antibodies.

Abstract Viruses which infect animals regularly spill over into the human population, but individual events may lead to anything from a single case to a novel pandemic. Rapidly gaining an understanding of a spillover event is critical to calibrating a public health response. We here propose a novel method, using likelihood free rejection sampling to evaluate the properties of an outbreak of swine-origin influenza A(H1N2)v in the United Kingdom, detected in November 2023. From the limited data available we generate historical estimates of the probability that the outbreak had died out in the days following the detection of the first case. Our method suggests that the outbreak could have been said to be over with 95% certainty between 19 and 29 days after the first case was detected, depending upon the probability of a case being detected. We further estimate the number of undetected cases conditional upon the outbreak still being live, the epidemiological parameter R 0 , and the date on which the spillover event itself occurred. Our method requires minimal data to be effective. While our calculations were performed after the event, the real-time application of our method has potential value for public health responses to cases of emerging viral infection.

Transmission between hosts is a critical part of the viral lifecycle. Recent studies of viral transmission have used genome sequence data to evaluate the number of particles transmitted between hosts, and the role of selection as it operates during the transmission process. However, the interpretation of sequence data describing transmission events is a challenging task. We here present a novel and comprehensive framework for using short-read sequence data to understand viral transmission events. Our model describes transmission as an event involving whole viruses, rather than independent alleles. We demonstrate how selection and noisy sequence data may each affect inferences of the population bottleneck, and identify circumstances in which selection for increased viral transmission may or may not be identified. Applying our model to data from a previous experimental transmission study, we show that our approach grants a more quantitative insight into viral transmission, inferring that between 2 to 6 viruses initiated infection, and allowing for a more informed interpretation of transmission events. While our model is here applied to influenza transmission, the framework we present is highly generalisable to other systems. Our work provides new opportunities for studying viral transmission.

The mechanism by which hepatitis C virus (HCV) gains entry into cells is a complex one, involving a broad range of host proteins. Entry is a critical phase of the viral lifecycle, and a potential target for therapeutic or vaccine-mediated intervention. However, the mechanics of HCV entry remain poorly understood. Here we describe a novel computational model of viral entry, encompassing the relationship between HCV and the key host receptors CD81 and SR-B1. We conduct experiments to thoroughly quantify the influence of an increase or decrease in receptor availability upon the extent of viral entry. We use these data to build and parameterise a mathematical model, which we then validate by further experiments. Our results are consistent with sequential HCV-receptor interactions, whereby initial interaction between the HCV E2 glycoprotein and SR-B1 facilitates the accumulation CD81 receptors, leading to viral entry. However, we also demonstrate that a small minority of virus can achieve entry in the absence of SR-B1. Our model estimates the impact of the different obstacles that viruses must surmount to achieve entry; among virus particles attaching to the cell surface, 20-35% accumulate sufficient CD81 receptors, of these 4-8% then complete the subsequent steps to achieve productive infection. Furthermore, we make estimates of receptor stoichiometry; between 3 and 6 CD81 receptors are likely to be required to achieve viral entry. Our model provides a tool to investigate the entry characteristics of HCV variants and outlines a framework for future quantitative studies of the multi-receptor dynamics of HCV entry.

Background: Infections with helminths cause an enormous disease burden in billions of animals and plants worldwide. Large scale use of anthelmintics has driven the evolution of resistance in a number of species that infect livestock and companion animals, and there are growing concerns regarding the reduced efficacy in some human-infective helminths. Understanding the mechanisms by which resistance evolves is the focus of increasing interest; robust genetic analysis of helminths is challenging, and although many candidate genes have been proposed, the genetic basis of resistance remains poorly resolved. Results: Here, we present a genome-wide analysis of two genetic crosses between ivermectin resistant and sensitive isolates of the parasitic nematode Haemonchus contortus, an economically important gastrointestinal parasite of small ruminants and a model for anthelmintic research. Whole genome sequencing of parental populations, and key stages throughout the crosses, identified extensive genomic diversity that differentiates populations, but after backcrossing and selection, a single genomic quantitative trait locus (QTL) localised on chromosome V was revealed to be associated with ivermectin resistance. This QTL was common between the two geographically and genetically divergent resistant populations and did not include any leading candidate genes, suggestive of a previously uncharacterised mechanism and/or driver of resistance. Despite limited resolution due to low recombination in this region, population genetic analyses and novel evolutionary models supported strong selection at this QTL, driven by at least partial dominance of the resistant allele, and that large resistance-associated haplotype blocks were enriched in response to selection. Conclusions: We have described the genetic architecture and mode of ivermectin selection, revealing a major genomic locus associated with ivermectin resistance, the most conclusive evidence to date in any parasitic nematode. This study highlights a novel genome-wide approach to the analysis of a genetic cross in non-model organisms with extreme genetic diversity, and the importance of a high quality reference genome in interpreting the signals of selection so identified.

The transmission bottleneck is defined as the number of viral particles transmitted from one host to another. Genome sequence data has been used to evaluate the size of the transmission bottleneck between humans infected with the influenza virus, however, the methods used to make these estimates have some limitations. Specifically, approaches using viral allele frequency data may not fully capture a process which involves the transmission of entire viral genomes. Here we set out a novel approach for inferring viral transmission bottlenecks; our method combines haplotype reconstruction, a method for inferring the composition of genomes in a viral population, with two maximum likelihood methods for bottleneck inference, tailored for small and large bottleneck sizes respectively. Our method allows for rapid calculation, and performs well when applied to data from simulated transmission events, being robust to errors in the haplotype reconstruction process. Applied to data from a previous household transmission study of influenza A infection we confirm the result that the majority of transmission events involve a small number of viruses, albeit with slightly looser bottlenecks being inferred, with between 1 and 13 particles transmitted in the majority of cases. While influenza A transmission involves a tight population bottleneck, the bottleneck is not so tight as to universally prevent the transmission of within-host viral diversity.

Background: Non-protein-coding regions of eukaryotic genomes remain poorly understood. Diversity studies, comparative genomics and biochemical outputs of genomic sites can be indicators of functional elements, but none produce fine-scale genome-wide descriptions of all functional elements. Results: Towards the generation of a comprehensive description of functional elements in the haploid Schizosaccharomyces pombe genome, we generated transposon mutagenesis libraries to a density of one insertion per 13 nucleotides of the genome. We applied a five-state hidden Markov model (HMM) to characterise insertion-depleted regions at nucleotide-level resolution. HMM-defined functional constraint was consistent with genetic diversity, comparative genomics, gene-expression data and genome annotation. Conclusions: We infer that transposon insertions lead to fitness consequences in 90% of the genome, including 80% of the non-protein-coding regions, reflecting the presence of numerous non-coding elements in this compact genome that have functional roles. Display of this data in genome browsers provides fine-scale views of structure-function relationships within specific genes.