Aberrant skipping of coding exons in CD19 and CD22 compromises responses to immunotherapy for B-cell malignancies. Here, we show that the MS4A1 gene encoding human CD20 also produces several mRNA isoforms with distinct 5' untranslated regions (5'-UTR). Four variants (V1-4) were detectable by RNA-seq in distinct stages of normal B-cell differentiation and B-lymphoid malignancies, with V1 and V3 being the most abundant by far. During B-cell activation and Epstein-Barr virus infection, redirection of splicing from V1 to V3 coincided with increased CD20 positivity. Similarly, in diffuse large B-cell lymphoma only V3, but not V1, correlated with CD20 protein levels, suggesting that V1 might be translation-deficient. Indeed, the longer V1 isoform was found to contain upstream open reading frames (uORFs) and a stem-loop structure, which cooperatively inhibited polysome recruitment. By modulating CD20 isoforms with splice-switching Morpholino oligomers, we enhanced CD20 expression and anti-CD20 antibody rituximab-mediated cytotoxicity in a panel of B-cell lines. Furthermore, reconstitution of CD20-knockout cells with V3 mRNA led to the recovery of CD20 positivity, while V1-reconstituted cells had undetectable levels of CD20 protein. Surprisingly, in vitro CD20-directed CAR T cells were able to kill both V3- and V1-expressing cells, but the bispecific T cell engager mosunetuzumab was only effective against V3-expressing cells. To determine whether CD20 splicing is involved in immunotherapy resistance, we performed RNA-seq on four post-mosunetuzumab follicular lymphoma relapses and discovered that in two of them downregulation of CD20 was accompanied by the V3-to-V1 shift. Thus, splicing-mediated mechanisms of epitope loss extend to CD20-directed immunotherapies.In normal & malignant human B cells, CD20 mRNA is alternatively spliced into four 5'-UTR isoforms, some of which are translation-deficient.The balance between translation-deficient and -competent isoforms modulates CD20 protein levels & responses to CD20-directed immunotherapies.We discovered that in normal and malignant B-cells, CD20 mRNA is alternatively spliced to generate four distinct 5'-UTRs, including the longer translation-deficient V1 variant. Cells predominantly expressing V1 were still sensitive to CD20-targeting chimeric antigen receptor T-cells. However, they were resistant to the bispecific anti-CD3/CD20 antibody mosunetuzumab, and the shift to V1 were observed in CD20-negative post-mosunetuzumab relapses of follicular lymphoma.

Abstract Relapse-specific mutations do not account for all chemotherapy failures in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). By mining RNA-seq datasets of paired diagnostic/relapse pediatric B-ALL samples, we discovered pervasive aberrant splicing (AS) patterns linked with relapse. They affected drivers of resistance to glucocorticoids, anti-folates, and thiopurines. Most splicing variations represent exon skipping, “poison” exon inclusion, and intron retention, phenocopying well-documented loss-of-function mutations. In addition, relapse-associated AS of NT5C2 mRNA yields an isoform with a cryptic 24-nt in-frame exon 6a. Inclusion of the extra 8 amino acids into this enzyme results in elevated nucleosidase activity, a known consequence of gain-of-function mutations in NT5C2 and a common determinant of 6-mercaptopurine resistance. Furthermore, in B-ALL cells NT5C2ex6a and the R238W hotspot variant confers comparable levels of resistance to 6-mercaptopurine in vitro and in vivo . These results support a role for alternative splicing as a prevalent mechanism driving chemotherapy resistance in relapsed B-ALL. Statement of significance Mutations in chemoresistance genes are found in relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. However, in this low-mutational-burden disease, up to 30% of cases have no known relapse-specific genetic alterations. Our identification of aberrant splicing as an alternative mechanism of acquired drug resistance fills this gap and suggests new opportunities for therapeutic interventions.