DNA methylation erasure is required for mammalian primordial germ cell reprogramming. TET enzymes iteratively oxidize 5-methylcytosine to generate 5-hyroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine, and 5-carboxycytosine to facilitate active genome demethylation. Whether these bases are required to promote replication-coupled dilution or activate base excision repair during germline reprogramming remains unresolved due to the lack of genetic models that decouple TET activities. Here, we generated two mouse lines expressing catalytically inactive TET1 ( Tet1-HxD ) and TET1 that stalls oxidation at 5hmC ( Tet1-V ). Tet1 -/- , Tet1 V/V , and Tet1 HxD/HxD sperm methylomes show that TET1 V and TET1 HxD rescue most Tet1 -/- hypermethylated regions, demonstrating the importance of TET1’s extra-catalytic functions. Imprinted regions, in contrast, require iterative oxidation. We further reveal a broader class of hypermethylated regions in sperm of Tet1 mutant mice that are excluded from de novo methylation during male germline development and depend on TET oxidation for reprogramming. Our study underscores the link between TET1-mediated demethylation during reprogramming and sperm methylome patterning.

ABSTRACT Innate immune memory is the process by which pathogen exposure elicits cell-intrinsic states to alter the strength of future immune challenges. Such altered memory states drive monocyte dysregulation during sepsis, promoting pathogenic behavior characterized by pro-inflammatory, immunosuppressive gene expression in concert with emergency hematopoiesis. Epigenetic changes, notably in the form of histone modifications, have been shown to underlie innate immune memory, but the contribution of DNA methylation to this process remains poorly understood. Using an ex vivo sepsis model, we discovered broad changes in DNA methylation throughout the genome of exhausted monocytes, including at several genes previously implicated as major drivers of immune dysregulation during sepsis and Covid-19 infection (e.g. Plac8 ). Methylome alterations are driven in part by Wnt signaling inhibition in exhausted monocytes, and can be reversed through treatment with DNA methyltransferase inhibitors, Wnt agonists, or immune training molecules. Importantly, these changes are recapitulated in septic mice following cecal slurry injection, resulting in stable changes at critical immune genes that support the involvement of DNA methylation in acute and long-term monocyte dysregulation during sepsis.

Abstract Background Chronic inflammation initiated by inflammatory monocytes underlies the pathogenesis of atherosclerosis. However, approaches that can effectively resolve chronic low-grade inflammation targeting monocytes are not readily available. The small chemical compound 4-phenylbutyric acid (4-PBA) exhibits broad anti-inflammatory effects in reducing atherosclerosis. Selective delivery of 4-PBA reprogrammed monocytes may hold novel potential in providing targeted and precision therapeutics for the treatment of atherosclerosis. Methods Systems analyses integrating single-cell RNA-sequencing and complementary immunological approaches characterized key resolving characteristics as well as defining markers of reprogrammed monocytes trained by 4-PBA. Molecular mechanisms responsible for monocyte reprogramming was assessed by integrated biochemical and genetic approaches. The inter-cellular propagation of homeostasis resolution was evaluated by co-culture assays with donor monocytes trained by 4-PBA and recipient naïve monocytes. The in vivo effects of monocyte resolution and atherosclerosis prevention by 4-PBA were assessed with the high fat diet-fed ApoE -/- mouse model with i.p. 4-PBA administration. Furthermore, the selective efficacy of 4-PBA trained monocytes were examined by i.v. transfusion of ex vivo trained monocytes by 4-PBA into recipient high fat diet-fed ApoE -/- mice. Results In this study, we found that monocytes can be potently reprogrammed by 4-PBA into an immune-resolving state characterized by reduced adhesion and enhanced expression of anti-inflammatory mediator CD24. Mechanistically, 4-PBA reduced the expression of ICAM-1 via reducing peroxisome stress and attenuating SYK-mTOR signaling. Concurrently, 4-PBA enhanced the expression of resolving mediator CD24 through promoting PPARγ neddylation mediated by TOLLIP. 4-PBA trained monocytes can effectively propagate anti-inflammation activity to neighboring monocytes through CD24. Our data further demonstrated that 4-PBA trained monocytes effectively reduce atherosclerosis pathogenesis when administered in vivo . Conclusion Our study describes a robust and effective approach to generate resolving monocytes, characterizes novel mechanisms for targeted monocyte reprogramming, and offers a precision-therapeutics for atherosclerosis based on delivering reprogrammed resolving monocytes.