Abstract Bacteriophages must seize control of the host gene expression machinery to promote their own protein synthesis. Since the bacterial hosts are armed with numerous anti-phage defence systems, it is essential that mechanisms of host take-over act immediately upon infection. Although individual proteins that modulate components of the bacterial gene expression apparatus have been described in several different phages, systematic approaches which capture the phage’s arsenal for immediate targeting of host transcription and translation processes have been lacking. In particular, there are no known phage factors that associate directly with host ribosomes to modulate protein synthesis. Here, we take an integrative high-throughput approach to uncover numerous new proteins encoded by the jumbo phage ΦKZ that target the gene expression machinery of the Gram-negative human pathogen Pseudomonas aeruginosa immediately upon infection. By integrating biochemical and structural analyses, we identify a conserved phage factor that associates with the large ribosomal subunit by binding the 5S ribosomal RNA. This highly abundant factor is amongst the earliest ΦKZ proteins expressed after infection and stays bound to ribosomes during the entire translation cycle. Our study provides a general strategy to decipher molecular components of phage-mediated host take-over and argues that phage genomes represent a large discovery space for proteins that modulate the host gene expression machinery.

The introduction of high-throughput sequencing has resulted in a surge of available bacteriophage genomes, unveiling their tremendous genomic diversity. However, our current understanding of the complex transcriptional mechanisms that dictate their gene expression during infection is limited to a handful of model phages. Here, we applied ONT-cappable-seq to reveal the transcriptional architecture of six different clades of virulent phages infecting Pseudomonas aeruginosa. This long-read microbial transcriptomics approach is tailored to globally map transcription start and termination sites, transcription units and putative RNA-based regulators on dense phage genomes. Specifically, the full-length transcriptomes of LUZ19, LUZ24, 14-1, YuA, PAK_P3 and giant phage phiKZ during early, middle and late infection were collectively charted. Beyond pinpointing traditional promoter and terminator elements and transcription units, these transcriptional profiles provide insights in transcriptional attenuation and splicing events and allow straightforward validation of Group I intron activity. In addition, ONT-cappable-seq data can guide genome-wide discovery of novel regulatory element candidates, including non-coding RNAs and riboswitches. This work substantially expands the number of annotated phage-encoded transcriptional elements identified to date, shedding light on the intricate and diverse gene expression regulation mechanisms in Pseudomonas phages, which can ultimately be sourced as tools for biotechnological applications in phage and bacterial engineering.

ABSTRACT The Gram-negative rod-shaped bacterium Pseudomonas aeruginosa is not only a major cause of nosocomial infections but also serves as a model species of bacterial RNA biology. While its transcriptome architecture and post-transcriptional regulation through the RNA-binding proteins Hfq, RsmA and RsmN have been studied in detail, global information about stable RNA–protein complexes is currently lacking in this human pathogen. Here, we implement Gradient profiling by sequencing (Grad-seq) in exponentially growing P. aeruginosa cells to comprehensively predict RNA and protein complexes, based on glycerol gradient sedimentation profiles of >73% of all transcripts and ∼40% of all proteins. As to benchmarking, our global profiles readily reported complexes of stable RNAs of P. aeruginosa , including 6S RNA with RNA polymerase and associated pRNAs. We observe specific clusters of non-coding RNAs, which correlate with Hfq and RsmA/N, and provide a first hint that P. aeruginosa expresses a ProQ-like FinO domain containing RNA-binding protein. To understand how biological stress may perturb cellular RNA/protein complexes, we performed Grad-seq after infection by the bacteriophage ΦKZ. This model phage, which has a well-defined transcription profile during host takeover, displayed efficient translational utilization of phage mRNAs and tRNAs, as evident from their increased co-sedimentation with ribosomal subunits. Additionally, Grad-seq experimentally determines previously overlooked phage-encoded non-coding RNAs. Taken together, the Pseudomonas protein and RNA complex data provided here will pave the way to a better understanding of RNA-protein interactions during viral predation of the bacterial cell. IMPORTANCE Stable complexes by cellular proteins and RNA molecules lie at the heart of gene regulation and physiology in any bacterium of interest. It is therefore crucial to globally determine these complexes in order to identify and characterize new molecular players and regulation mechanisms. Pseudomonads harbour some of the largest genomes known in bacteria, encoding ∼5,500 different proteins. Here, we provide a first glimpse on which proteins and cellular transcripts form stable complexes in the human pathogen Pseudomonas aeruginosa . We additionally performed this analysis with bacteria subjected to the important and frequently encountered biological stress of a bacteriophage infection. We identified several molecules with established roles in a variety of cellular pathways, which were affected by the phage and can now be explored for their role during phage infection. Most importantly, we observed strong co-localization of phage transcripts and host ribosomes, indicating the existence of specialized translation mechanisms during phage infection. All data are publicly available in an interactive and easy to use browser.