Microalgae are regarded as promising organisms to develop innovative concepts based on their photosynthetic capacity that offers more sustainable production than heterotrophic hosts. However, to realize their potential as green cell factories, a major challenge is to make microalgae easier to engineer. A promising approach for rapid and predictable genetic manipulation is to use standardized synthetic biology tools and workflows. To this end we have developed a Modular Cloning toolkit for the green microalga Chlamydomonas reinhardtii. It is based on Golden Gate cloning with standard syntax, and comprises 119 openly distributed genetic parts, most of which have been functionally validated in several strains. It contains promoters, UTRs, terminators, tags, reporters, antibiotic resistance genes, and introns cloned in various positions to allow maximum modularity. The toolkit enables rapid building of engineered cells for both fundamental research and algal biotechnology. This work will make Chlamydomonas the next chassis for sustainable synthetic biology.

Abstract Microbial production of heterologous metabolites is now a mature technology in many host organisms, opening new avenues for green production processes for specialty chemicals. At lab scale, petroleum-based hydrophobic bio-compatible solvents like dodecane can be used as a second phase on top of microbial cultures to act as a physical sink for heterologous hydrocarbon products like isoprenoids. However, this approach has significant drawbacks at scale due to the difficulty of handling solvents and their potential contamination with unwanted byproducts of their manufacture. We discovered that synthetic perfluorocarbon liquids (FCs), commonly used for heat transfer, can also act as physical sinks for microbially produced isoprenoid compounds. FCs are stable, inert, and are amenable to direct liquid-liquid extraction with alcohols for rapid product isolation. These liquids are more dense than water and form a lower phase to microbial cultures rather than an upper phase as with other solvents. Their ability to form an under-layer or ‘underlay’ also enables the cultivation of microbes directly at the FC-culture medium interface via gravity settling, which could open their application for filamentous or mat-forming organisms. We present comparisons of the isoprenoid extraction potential of three commercial FCs: FC-3283, FC-40, and FC-770 with engineered green microalga cultures producing patchoulol, taxadiene, casbene, or 13R(+) manoyl oxide. We demonstrate that FCs are promising alternatives to traditional solvents and open new avenues in bio-process design for microbial heterologous metabolite milking.

Abstract The polyextremophilic Cyanidiales are eukaryotic red microalgae with promising biotechnological properties arising from their low pH and elevated temperature requirements which can minimize culture contamination at scale. Cyanidioschyzon merolae 10D is a cell wall deficient species with a fully sequenced genome that is amenable to nuclear transgene integration by targeted homologous recombination. C. merolae maintains a minimal carotenoid profile and here, we sought to determine its capacity for ketocarotenoid accumulation mediated by heterologous expression of a green algal β-carotene ketolase (BKT) and hydroxylase (CHYB). To achieve this, a synthetic transgene expression cassette system was built to integrate and express Chlamydomonas reinhardtii ( Cr ) sourced enzymes by fusing native C. merolae transcription, translation and chloroplast targeting signals to codon-optimized coding sequences. Chloramphenicol resistance was used to select for the integration of synthetic linear DNAs into a neutral site within the host genome. Cr BKT expression caused accumulation of canthaxanthin and adonirubin as major carotenoids while co-expression of Cr BKT with Cr CHYB generated astaxanthin as the major carotenoid in C. merolae . Unlike green algae and plants, ketocarotenoid accumulation in C. merolae did not reduce total carotenoid contents, but chlorophyll a reduction was observed. Light intensity affected global ratios of all pigments but not individual pigment compositions and phycocyanin contents were not markedly different between parental strain and transformants. Continuous illumination was found to encourage biomass accumulation and all strains could be cultivated in simulated summer conditions from two different extreme desert environments. Our findings present the first example of carotenoid metabolic engineering in a red eukaryotic microalga and open the possibility for use of C. merolae 10D for simultaneous production of phycocyanin and ketocarotenoid pigments. Abstract Figure

Abstract Chlamydomonas reinhardtii has emerged as a powerful green cell factory for metabolic engineering of sustainable products created from the photosynthetic lifestyle of this microalga. Advances in nuclear genome and transgene expression engineering are allowing robust engineering strategies to be demonstrated in this host. However, commonly used lab strains are not equipped with features to enable their broader implementation in non-sterile conditions and high-cell density concepts. Here, we use combinatorial chloroplast and nuclear genome engineering to complement the C. reinhardtii strain UVM4 with publicly available genetic tools to enable the use of inorganic phosphite and nitrate as a sole the source phosphorous and nitrogen, respectively. We present recipes to create phosphite-buffered media solutions that enable high cell density algal cultivation. We then combine previously reported engineering strategies to produce the heterologous sesquiterpenoid patchoulol to high titers from our engineered green cell factories and show these products are possible to produce in under non-sterile conditions. Our work presents a straightforward means to generate C. reinhardtii strains for broader application in bio-processes for the sustainable generation of products.

Terpenoids play key roles in cellular metabolism, with some organisms having evolved expanded terpenoid profiles for specialized functions such as signaling and defense. Many terpenoids have applications in pharmaceuticals, fragrances, and agriculture, but their harvest from natural sources can be challenging. Heterologous production of specialty terpenoids in microbial hosts offers an alternative, using terpene synthases and further enzymatic decoration to expand chemical complexity and functionality. Here, we explored the heterologous production of 10 different sesquiterpenoids (STPs, C15) and their further biofunctionalization mediated by cytochrome P450s (CYPs) in the green alga Chlamydomonas reinhardtii . STP synthases were expressed from the nuclear genome and localized to the algal plastid, coupled with co-expression of selected CYPs. STP production in the plastid was supported by farnesyl pyrophosphate synthase fusions to STP synthases, and CYPs were modified for soluble localization in the plastid stroma by removing transmembrane domains. Various target CYPs were screened for STP functionalization in the alga, and different product ratios were generated based on trophic modes. Overall STP yields ranged between 250-2500 μg/L under screening conditions, with CYP-mediated functionalization reaching up to 80% of accumulated heterologous STP products. Living two-phase terpenoid extractions with different perfluorinated solvents revealed variable performances based on sesquiterpenoid functionalization and solvent type. This work demonstrates the feasibility of generating heterologous functionalized terpenoid products in alga using soluble, plastid-localized CYPs without reductase partners. However, overall improvements in photobioreactor cultivation concepts will be required to facilitate the use of algal chassis for scaled production.

1. Abstract Wastewater (WW) treatment in anaerobic membrane bioreactors (AnMBR) is considered more sustainable than in their aerobic counterparts. However, outputs from AnMBR are mixed methane and carbon dioxide gas streams as well as ammonium- (N) and phosphate- (P) containing waters. Using AnMBR outputs as inputs for photoautotrophic algal cultivation can strip the CO 2 and remove N and P from effluent which feed algal biomass generation. Recent advances in algal engineering have generated strains for concomitant high-value side product generation in addition to biomass, although only shown in heavily domesticated, lab-adapted strains. Here, investigated whether such a strain of Chlamydomonas reinhardtii could be grown directly in AnMBR effluent with CO 2 at concentrations found in its off-gas. The domesticated strain was found to proliferate over bacteria in the non-sterile effluent, consume N and P to levels that meet general discharge or reuse limits, and tolerate cultivation in modelled (extreme) outdoor environmental conditions prevalent along the central Red Sea coast. High-value co-product milking was then demonstrated, up to 837 μg L −1 culture in 96 h, in addition to algal biomass production, ∼2.4 g CDW L −1 in 96 h, directly in effluents. This is the first demonstration of a combined bio-process that employs a heavily engineered algal strain to enhance the product generation potentials from AnMBR effluent treatment. This study shows it is possible to convert waste into value through use of engineered algae while also improve wastewater treatment economics through co-product generation. Abstract Figure

Thymelaceaous trees are prized for accumulating fragrant resins composed of hundreds of secondary metabolites in their woody tissues. Slow growth and increasing consumer demand have stretched natural sources of agarwood trees to being endangered and alternative production modes, including silviculture and tissue culture, are currently being investigated. Dedifferentiated tissue culture of agarwood trees provide a means of cell propagation independent of environmental context. However, secondary metabolite accumulation as found in fragrant resins, occurs largely in response to wounding. Here, we investigated the application of metal-organic frameworks (MOFs) as potential elicitors of secondary metabolite formation in Aquilaria crassna tissue culture samples. Callus cultures were exposed to five commercially available MOFs: UiO-67, MOF-808, HKUST-1, ZIF-67, and MOF-74, and ethanol extracts were used to quantify secondary metabolite accumulation compared to untreated cultures. Samples that were exposed to Zr-based MOFs exhibited similar metabolite production profiles, (trans-2-Carboxy-cyclo-hexyl)-acetic acid was reduced in the presence of all MOFs, the Cu-containing HKUST-1 MOF increased palmitic acid levels, and MOF-808 and ZIF-67 were found to elicit the highest accumulation of secondary metabolites with potential fragrance applications. These results demonstrate the possibility of eliciting secondary metabolites from dedifferentiated agarwood tree cell culture and may provide an alternative means of sourcing fragrant specialty chemicals from these plants.

Abstract The west coast of Saudi Arabia borders the Red Sea, which maintains high average temperatures and increased salinity compared to other seas or oceans. Summer conditions in the Arabian Peninsula may exceed the temperature tolerance of most currently cultivated microalgae. The Cyanidiales are polyextremophilic red algae whose native habitats are at the edges of acidic hot springs. Cyanidioschyzon merolae 10D has recently emerged as an interesting model organism capable of high-cell density cultivation on pure CO 2 with optimal growth at 42 °C and low pH between 0.5-2. C. merolae biomass has an interesting macromolecular composition, is protein rich, and contains valuable bio-products like heat-stable phycocyanin, carotenoids, β-glucan, and starch. Here, photobioreactors were used to model C. merolae 10D growth performance in simulated environmental conditions of the mid-Red Sea coast across four seasons, it was then grown at various scales outdoors in Thuwal, Saudi Arabia during the Summer of 2022. We show that C. merolae 10D is amenable to cultivation with industrial-grade nutrient and CO 2 inputs outdoors in this location and that its biomass is relatively constant in biochemical composition across culture conditions. We also show the adaptation of C. merolae 10D to high salinity levels of those found in Red Sea waters and conducted further modeled cultivations in nutrient enriched local sea water. It was determined that salt-water adapted C. merolae 10D could be cultivated with reduced nutrient inputs in local conditions. The results presented here indicate this may be a promising alternative species for algal bioprocesses in outdoor conditions in extreme desert summer environments.

The green alga Chlamydomonas reinhardtii does not synthesize high-value ketocarotenoids like canthaxanthin and astaxanthin, however, a β-carotene ketolase (CrBKT) can be found in its genome. CrBKT is poorly expressed, contains a long C-terminal extension not found in homologues and likely represents a pseudogene in this alga. Here, we used synthetic re-design of this gene to enable its constitutive overexpression from the nuclear genome of C. reinhardtii. Overexpression of the optimized CrBKT extended native carotenoid biosynthesis to generate ketocarotenoids in the algal host causing noticeable changes the green algal colour to a reddish-brown. We found that up to 50% of native carotenoids could be converted into astaxanthin and more than 70% into other ketocarotenoids by robust CrBKT overexpression. Modification of the carotenoid metabolism did not impair growth or biomass productivity of C. reinhardtii, even at high light intensities. Under different growth conditions, the best performing CrBKT overexpression strain was found to reach ketocarotenoid productivities up to 4.5 mg L-1 day-1. Astaxanthin productivity in engineered C. reinhardtii shown here is competitive with that reported for Haematococcus lacustris (formerly pluvialis) which is currently the main organism cultivated for industrial astaxanthin production. In addition, the extractability and bio-accessibility of these pigments was much higher in cell wall deficient C. reinhardtii than the resting cysts of H. lacustris. Engineered C. reinhardtii strains could thus be a promising alternative to natural astaxanthin producing algal strains and may open the possibility of other tailor-made pigments from this host.

1. Abstract Isoprene is a clear, colorless, volatile 5-carbon hydrocarbon that is one monomer of all cellular isoprenoids and a platform chemical with multiple applications in industry. Many plants have evolved isoprene synthases (IspSs) with the capacity to liberate isoprene from dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) as part of cellular protection mechanisms. Isoprene is hydrophobic and volatile, rapidly leaves plant tissues and is one of the main carbon emission sources from vegetation globally. The universality of isoprenoid metabolism allows volatile isoprene production from microbes expressing heterologous IspSs. Here, we compared heterologous overexpression from the nuclear genome and localization into the plastid of four plant terpene synthases (TPs) in the green microalga Chlamydomonas reinhardtii . Using sealed vial mixotrophic cultivation, direct quantification of isoprene production was achieved from the headspace of living cultures, with the highest isoprene production observed in algae expressing the Ipomoea batatas IspS. Perturbations of the downstream carotenoid pathway through keto carotenoid biosynthesis enhanced isoprene titers, which could be further enhanced by increasing flux towards DMAPP through heterologous co-expression of a yeast isopentenyl-PP delta isomerase. Multiplexed controlled-environment testing revealed that cultivation temperature, rather than illumination intensity, was the main factor affecting isoprene yield from the engineered alga. This is the first report of heterologous isoprene production from a eukaryotic alga and sets a foundation for further exploration of carbon conversion to this commodity chemical. Abstract Figure