We report experimental measurements of the salt dependence of ion transport and DNA translocation through solid-state nanopores. The ionic conductance shows a three-order-of-magnitude decrease with decreasing salt concentrations from 1 M to 1 μM, strongly deviating from bulk linear behavior. The data are described by a model that accounts for a salt-dependent surface charge of the pore. Subsequently, we measure translocation of 16.5-μm-long dsDNA for 50 mM to 1 M salt concentrations. DNA translocation is shown to result in either a decrease ([KCl] > 0.4 M) or increase of the ionic current ([KCl] < 0.4 M). The data are described by a model where current decreases result from the partial blocking of the pore and current increases are attributed to motion of the counterions that screen the charge of the DNA backbone. We demonstrate that the two competing effects cancel at a KCl concentration of 370 ± 40 mM.

Among the variety of roles for nanopores in biology, an important one is enabling polymer transport, for example in gene transfer between bacteria1 and transport of RNA through the nuclear membrane2. Recently, this has inspired the use of protein3,4,5 and solid-state6,7,8,9,10 nanopores as single-molecule sensors for the detection and structural analysis of DNA and RNA by voltage-driven translocation. The magnitude of the force involved is of fundamental importance in understanding and exploiting this translocation mechanism, yet so far it has remained unknown. Here, we demonstrate the first measurements of the force on a single DNA molecule in a solid-state nanopore by combining optical tweezers11 with ionic-current detection. The opposing force exerted by the optical tweezers can be used to slow down and even arrest the translocation of the DNA molecules. We obtain a value of 0.24±0.02 pN mV−1 for the force on a single DNA molecule, independent of salt concentration from 0.02 to 1 M KCl. This force corresponds to an effective charge of 0.50±0.05 electrons per base pair equivalent to a 75% reduction of the bare DNA charge.

Diffusion in the plasma membrane of living cells is often found to display anomalous dynamics. However, the mechanism underlying this diffusion pattern remains highly controversial. Here, we study the physical mechanism underlying Kv2.1 potassium channel anomalous dynamics using single-molecule tracking. Our analysis includes both time series of individual trajectories and ensemble averages. We show that an ergodic and a nonergodic process coexist in the plasma membrane. The ergodic process resembles a fractal structure with its origin in macromolecular crowding in the cell membrane. The nonergodic process is found to be regulated by transient binding to the actin cytoskeleton and can be accurately modeled by a continuous-time random walk. When the cell is treated with drugs that inhibit actin polymerization, the diffusion pattern of Kv2.1 channels recovers ergodicity. However, the fractal structure that induces anomalous diffusion remains unaltered. These results have direct implications on the regulation of membrane receptor trafficking and signaling.

Abstract Mean-Shift Super Resolution (MSSR) is a principle based on the Mean Shift theory that extends spatial resolution in fluorescence images, beyond the diffraction limit. MSSR works on low- and high-density fluorophore images, is not limited by the architecture of the detector (EM-CCD, sCMOS, or photomultiplier-based laser scanning systems) and is applicable to single images as well as temporal series. The theoretical limit of spatial resolution, based on optimized real-world imaging conditions and analysis of temporal image series, has been measured to be 40 nm. Furthermore, MSSR has denoising capabilities that outperform other analytical super resolution image approaches. Altogether, MSSR is a powerful, flexible, and generic tool for multidimensional and live cell imaging applications.

Sperm capacitation, crucial for fertilization, occurs in the female reproductive tract and can be replicated

Abstract Post-translational protein modifications play an important role in the regulation of gene dynamics. Certain modifications, such as histone acetylation and RNA polymerase II phosphorylation, are associated with transcriptionally active chromatin. However, the spatial and temporal relationship between chromatin and post-translational protein modifications, and how these dynamics facilitate selective gene expression, remain poorly understood. In this study, we address this problem by developing a general methodology for quantifying in live cells the dynamics of chromatin across multiple time and length scales in the context of residue-specific protein modifications. By combining Fab-based labeling of endogenous protein modifications with single-molecule imaging, we track the dynamics of chromatin enriched with histone H3 Lysine-27 acetylation (H3K27ac) and RNA polymerase II Serine-5 phosphorylation (RNAP2-Ser5ph). Our analysis reveals chromatin enriched with H3K27ac is separated from chromatin enriched with RNAP2-Ser5ph. Furthermore, in these separated sites, we show the presence of the two modifications are inversely correlated with one another on the minutes timescale. We then track single nucleosomes in both types of sites on the sub-second timescale and again find evidence for distinct and opposing changes in their diffusive behavior. While nucleosomes diffuse ∼15% faster in chromatin enriched with H3K27ac, they diffuse ∼15% slower in chromatin enriched with RNAP2-Ser5ph. Taken together, these results argue that high levels of H3K27ac and RNAP2-Ser5ph are not often present together at the same place and time, but rather each modification marks distinct sites that are transcriptionally poised or active, respectively.

Mammalian sperm delve into the female reproductive tract to fertilize the female gamete. The available information about how sperm regulate their motility during the final journey to the fertilization site is extremely limited. In this work, we investigated the structural and functional changes in the sperm flagellum after acrosomal exocytosis and during the interaction with the eggs. The evidence demonstrates that the double helix actin network surrounding the mitochondrial sheath of the midpiece undergoes structural changes prior to the motility cessation. This structural modification is accompanied by a decrease in diameter of the midpiece and is driven by intracellular calcium changes that occur concomitant with a reorganization of the actin helicoidal cortex. Although midpiece contraction may occur in a subset of cells that undergo acrosomal exocytosis, live-cell imaging during in vitro fertilization showed that the midpiece contraction is required for motility cessation after fusion is initiated. These findings provide the first evidence of the F-actin network's role in regulating sperm motility, adapting its function to meet specific cellular requirements during fertilization, and highlighting the broader significance of understanding sperm motility.

Mammalian sperm delve into the female reproductive tract to fertilize the female gamete. The available information about how sperm regulate their motility during the final journey to the fertilization site is extremely limited. In this work, we investigated the structural and functional changes in the sperm flagellum after acrosomal exocytosis (AE) and during the interaction with the eggs. The evidence demonstrates that the double helix actin network surrounding the mitochondrial sheath of the midpiece undergoes structural changes prior to the motility cessation. This structural modification is accompanied by a decrease in diameter of the midpiece and is driven by intracellular calcium changes that occur concomitant with a reorganization of the actin helicoidal cortex. Midpiece contraction occurs in a subset of cells that undergo AE, and live-cell imaging during in vitro fertilization showed that the midpiece contraction is required for motility cessation after fusion is initiated. These findings provide the first evidence of the F-actin network’s role in regulating sperm motility, adapting its function to meet specific cellular requirements during fertilization, and highlighting the broader significance of understanding sperm motility.

Conception of a new mammalian organism is determined by the fusion of a sperm cell with an oocyte during fertilization. Motility is one of the features of sperm that allows them to succeed in fertilization, and their flagellum is essential for this function. Longitudinally, the flagellum divides into the midpiece, the principal piece, and the end piece. A precise cytoskeletal architecture of the sperm tail is key for the acquisition of fertilization competence. It has been proposed that the actin cytoskeleton plays essential roles in the regulation of sperm motility, however, actin organization in sperm remains elusive. In the present work, we found different types of actin structures in the sperm tail, using stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). In the principal piece, actin is radially distributed between the axoneme and the plasma membrane. The actin-associated proteins spectrin and adducin are also found in these structures. Strikingly, polymerized actin in the midpiece forms a double-helix that accompanies mitochondria. Our findings illustrate a novel specialized structure of actin filaments in a mammalian cell.

Agonist binding to the mu opioid receptor (MOR) results in conformational changes that allow recruitment of G-proteins, activation of downstream effectors and eventual desensitization and internalization, all of which could affect receptor mobility. The present study employed single particle tracking (SPT) of quantum dot labeled FLAG-tagged MORs to examine shifts in MOR mobility after agonist binding. FLAG-MORs on the plasma membrane were in both mobile and immobile states under basal conditions. Activation of FLAG-MORs with DAMGO caused an acute increase in the fraction of mobile MORs, and free portions of mobile tracks were partially dependent on interactions with G-proteins. In contrast, 10-minute exposure to DAMGO or morphine increased the fraction of immobile FLAG-MORs. While the decrease in mobility with prolonged DAMGO exposure corresponded to an increase in colocalization with clathrin, the increase in colocalization was present in both mobile and immobile FLAG-MORs. Thus, no single mobility state of the receptor accounted for colocalization with clathrin. These findings demonstrate that SPT can be used to track agonist-dependent changes in MOR mobility over time, but that the mobility states observed likely arise from a diverse set of interactions and will be most informative when examined in concert with particular downstream effectors.