TS
Timothy Stasevich
Author with expertise in Ribosome Structure and Translation Mechanisms
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
25
(60% Open Access)
Cited by:
1,114
h-index:
28
/
i10-index:
51
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling

Yoko Hayashi‐Takanaka et al.May 14, 2011
Histone modifications play an important role in epigenetic gene regulation and genome integrity. It remains largely unknown, however, how these modifications dynamically change in individual cells. By using fluorescently labeled specific antigen binding fragments (Fabs), we have developed a general method to monitor the distribution and global level of endogenous histone H3 lysine modifications in living cells without disturbing cell growth and embryo development. Fabs produce distinct nuclear patterns that are characteristic of their target modifications. H3K27 trimethylation-specific Fabs, for example, are concentrated on inactive X chromosomes. As Fabs bind their targets transiently, the ratio of bound and free molecules depends on the target concentration, allowing us to measure changes in global modification levels. High-affinity Fabs are suitable for mouse embryo imaging, so we have used them to monitor H3K9 and H3K27 acetylation levels in mouse preimplantation embryos produced by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. The data suggest that a high level of H3K27 acetylation is important for normal embryo development. As Fab-based live endogenous modification labeling (FabLEM) is broadly useful for visualizing any modification, it should be a powerful tool for studying cell signaling and diagnosis in the future.
0
Citation237
0
Save
24

Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells

Charlotte Cialek et al.Apr 30, 2021
ABSTRACT A major challenge to our understanding of translational control has been deconvolving the individual impact specific regulatory factors have on the complex dynamics of mRNA translation. MicroRNAs (miRNAs), for example, guide Argonaute and associated proteins to target mRNAs, where they direct gene silencing in multiple ways that are not well understood. To better deconvolve these dynamics, we have developed technology to directly visualize and quantify the impact of human Argonaute2 (Ago2) on the translation and subcellular localization of individual reporter mRNAs in living cells. We show that our combined translation and Ago2 tethering system reflects endogenous miRNA-mediated gene silencing. Using the system, we find that Ago2 association leads to progressive silencing of translation at individual mRNA. The timescale of silencing was similar to that of translation, consistent with a role for Ago2 in blocking translation initiation, leading to ribosome runoff. At early time points, we observed occasional brief bursts of translational activity at Ago2-tethered mRNAs undergoing silencing, suggesting that translational repression may initially be reversible. At later time points, Ago2-tethered mRNAs cluster and coalesce with endogenous P-bodies, where a translationally silent state is maintained. These results provide a framework for exploring miRNA-mediated gene regulation in live cells at the single-molecule level. Furthermore, our tethering-based, single-molecule reporter system will likely have wide-ranging application in studying general RNA-protein interactions.
24
Citation3
0
Save
1

Live-cell imaging uncovers the relationship between histone acetylation, transcription initiation, and nucleosome mobility

Matthew Saxton et al.Mar 3, 2023
Abstract Post-translational protein modifications play an important role in the regulation of gene dynamics. Certain modifications, such as histone acetylation and RNA polymerase II phosphorylation, are associated with transcriptionally active chromatin. However, the spatial and temporal relationship between chromatin and post-translational protein modifications, and how these dynamics facilitate selective gene expression, remain poorly understood. In this study, we address this problem by developing a general methodology for quantifying in live cells the dynamics of chromatin across multiple time and length scales in the context of residue-specific protein modifications. By combining Fab-based labeling of endogenous protein modifications with single-molecule imaging, we track the dynamics of chromatin enriched with histone H3 Lysine-27 acetylation (H3K27ac) and RNA polymerase II Serine-5 phosphorylation (RNAP2-Ser5ph). Our analysis reveals chromatin enriched with H3K27ac is separated from chromatin enriched with RNAP2-Ser5ph. Furthermore, in these separated sites, we show the presence of the two modifications are inversely correlated with one another on the minutes timescale. We then track single nucleosomes in both types of sites on the sub-second timescale and again find evidence for distinct and opposing changes in their diffusive behavior. While nucleosomes diffuse ∼15% faster in chromatin enriched with H3K27ac, they diffuse ∼15% slower in chromatin enriched with RNAP2-Ser5ph. Taken together, these results argue that high levels of H3K27ac and RNAP2-Ser5ph are not often present together at the same place and time, but rather each modification marks distinct sites that are transcriptionally poised or active, respectively.
1
Citation2
0
Save
73

Synonymous codon usage regulates translation initiation

Chloe Barrington et al.May 13, 2022
ABSTRACT Synonymous codon usage regulates gene expression such that transcripts rich in optimal codons produce significantly more protein than their nonoptimal counterparts. A major unresolved issue has been understanding the mechanisms by which synonymous codons regulate gene expression. We and others have previously shown that nonoptimal codons slow translation elongation speeds and thereby trigger mRNA degradation. However, differences in transcript abundance are not always sufficient to explain differences in protein levels, suggesting there are additional mechanisms by which codon usage regulates gene expression. Using reporter assays in human and Drosophila cells, we found that transcript levels account for less than half of the variation in protein abundance. We demonstrate that the differences at the protein level are not attributable to either protein folding or stability. Instead, we find that mRNAs with nonoptimal codons are bound by fewer ribosomes and that nonoptimal codon usage represses translation initiation. Nonoptimal transcripts are also less bound by the key translation initiation factors eIF4E and eIF4G, providing a mechanistic explanation for their reduced initiation rates. Our results reveal a new mechanism of regulation by codon usage, where nonoptimal codons repress further rounds of translation.
73
Citation2
0
Save
1

Single molecule imaging of the central dogma reveals myosin-2A gene expression is regulated by contextual translational buffering

O’Neil Wiggan et al.Feb 11, 2024
While protein homeostasis is a hallmark of gene regulation, unraveling the hidden regulatory mechanisms that maintain homeostasis is difficult using traditional methods. To confront this problem, we CRISPR engineered a human cell line with multiple tags in the endogenous MYH9 gene, which encodes the essential and ubiquitous myosin-2A cytoskeletal motor. Using these cells, we imaged MYH9 transcription, translation, and mature mRNA and protein in distinct colors, enabling a full dissection of the central dogma. Our data show that MYH9 transcription is upregulated in an SRF-dependent manner in response to cytoskeletal cues and that MYH9 translation can either buffer or match the transcriptional response depending on context. Upon knockdown of actin-depolymerizing proteins like cofilin, translation efficiency drops by a factor of two to buffer strong transcriptional upregulation, likely to help prevent excessive myosin activity. In contrast, following serum stimulation, translation matches the transcriptional response to readily reestablish steady state. Our results identify contextual translational buffering as an important regulatory mechanism driving stable MYH9 expression. They also demonstrate the power and broad applicability of our cell line, which can now be used to accurately quantify central dogma dynamics in response to diverse forms of cellular perturbations.
1
Citation1
0
Save
0

Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules

Stephanie Moon et al.Jan 6, 2020
Stress granules (SGs) are dynamic assemblies of non-translating RNAs and proteins that form with translation inhibition [1]. Stress granules are similar to neuronal and germ cell granules, play a role in survival during stress, and aberrant, cytotoxic SGs are implicated in neurodegeneration [2-4]. Perturbations in the ubiquitin-proteasome (UPS) system also cause neurodegeneration [5-10], and alter the dynamicity and kinetics of SGs [11-14]. Using single mRNA imaging in live cells [15,16], we took an unbiased approach to determine if defects in the UPS perturb mRNA translation and partitioning into SGs during acute stress. We observe ribosomes stall on mRNAs during arsenite stress, and the release of transcripts from stalled ribosomes for their partitioning into SGs requires the activities of valosin-containing protein (VCP) and the proteasome, which is in contrast to previous work showing VCP primarily affected SG disassembly [11,13,14,17]. Moreover, members of a specialized complex in the UPS that targets aberrant nascent proteins for decay upon ribosome stalling, referred to as ribosome-associated quality control complex (RQC) [18], are also required for mRNA release from ribosomes and partitioning into SGs. VCP alleles that increase segregase activity and cause neurodegeneration and inclusion body myopathies [5,6,19,20] increase mRNA recruitment to SGs, suggesting aberrant mRNA localization to SGs in disease contexts. This work identifies a new type of stress-activated RQC (saRQC) distinct from canonical RQC pathways in mRNA substrates, cellular context and mRNA fate.
13

Protein manipulation using single copies of short peptide tags in cultured cells and inDrosophila melanogaster

M Viganò et al.Apr 7, 2020
Abstract Cellular development and specialized cellular functions are regulated processes which rely on highly dynamic molecular interactions among proteins, distributed in all cell compartments. Analysis of these interactions and their mechanisms of action has been one of the main topics in cellular and developmental research over the last fifty years. Studying and understanding the functions of proteins of interest (POIs) has been mostly achieved by their alteration at the genetic level and the analysis of the phenotypic changes generated by these alterations. Although genetic and reverse genetic technologies contributed to the vast majority of information and knowledge we have gathered so far, targeting specific interactions of POIs in a time- and space-controlled manner or analyzing the role of POIs in dynamic cellular processes such as cell migration or cell division would require more direct approaches. The recent development of specific protein binders, which can be expressed and function intracellularly, together with several improvements in synthetic biology techniques, have contributed to the creation of a new toolbox for direct protein manipulations. We selected a number of short tag epitopes for which protein binders from different scaffolds have been developed and tested whether these tags can be bound by the corresponding protein binders in living cells when they are inserted in a single copy in a POI. We indeed find that in all cases, a single copy of a short tag allows protein binding and manipulation. Using Drosophila , we also find that single short tags can be recognized and allow degradation and relocalization of POIs in vivo .
Load More