Recently, we documented that the short, proline-rich antibacterial peptides pyrrhocoricin, drosocin, and apidaecin interact with the bacterial heat shock protein DnaK, and peptide binding to DnaK can be correlated with antimicrobial activity. In the current report we studied the mechanism of action of these peptides and their binding sites to Escherichia coli DnaK. Biologically active pyrrhocoricin made of l-amino acids diminished the ATPase activity of recombinant DnaK. The inactive d-pyrrhocoricin analogue and the membrane-active antibacterial peptide cecropin A or magainin 2 failed to inhibit the DnaK-mediated phosphate release from adenosine 5‘-triphosphate (ATP). The effect of pyrrhocoricin on DnaK's other significant biological function, the refolding of misfolded proteins, was studied by assaying the alkaline phosphatase and β-galactosidase activity of live bacteria. Remarkably, both enzyme activities were reduced upon incubation with l-pyrrhocoricin or drosocin. d-Pyrrhocoricin, magainin 2, or buforin II, an antimicrobial peptide involved in binding to bacterial nucleic acids, had only negligible effect. According to fluorescence polarization and dot blot analysis of synthetic DnaK fragments and labeled pyrrhocoricin analogues, pyrrhocoricin bound with a Kd of 50.8 μM to the hinge region around the C-terminal helices D and E, at the vicinity of amino acids 583 and 615. Pyrrhocoricin binding was not observed to the homologous DnaK fragment of Staphylococcus aureus, a pyrrhocoricin nonresponsive strain. In line with the lack of ATPase inhibition, drosocin binding appears to be slightly shifted toward the D helix. Our data suggest that drosocin and pyrrhocoricin binding prevents the frequent opening and closing of the multihelical lid over the peptide-binding pocket of DnaK, permanently closes the cavity, and inhibits chaperone-assisted protein folding. The biochemical results were strongly supported by molecular modeling of DnaK−pyrrhocoricin interactions. Due to the prominent sequence variations of procaryotic and eucaryotic DnaK molecules in the multihelical lid region, our findings pave the road for the design of strain-specific antibacterial peptides and peptidomimetics. Far-fetched applications of the species-specific inhibition of chaperone-assisted protein folding include the control of not only bacteria but also fungi, parasites, insects, and perhaps rodents.

Proteolytic degradation of peptide-based drugs is often considered as major weakness limiting systemic therapeutic applications. Therefore, huge efforts are typically devoted to stabilize sequences against proteases present in serum or plasma, obtained as supernatants after complete blood coagulation or centrifugation of blood supplemented with anticoagulants, respectively. Plasma and serum are reproducibly obtained from animals and humans allowing consistent for clinical analyses and research applications. However, the spectrum of active or activated proteases appears to vary depending on the activation of proteases and cofactors during coagulation (serum) or inhibition of such enzymes by anticoagulants (plasma), such as EDTA (metallo- and Ca2+-dependent proteases) and heparin (e.g. thrombin, factor Xa). Here, we studied the presumed effects on peptide degradation by taking blood via cardiac puncture of CD-1 mice using a syringe containing a peptide solution. Due to absence of coagulation activators (e.g. glass surfaces and damaged cells), visible blood clotting was prevented allowing to study peptide degradation for one hour. The remaining peptide was quantified and the degradation products were identified using mass spectrometry. When the degradation rates (half-life times) were compared to serum derived freshly from the same animal and commercial serum and plasma samples, peptides of three different families showed indeed considerably different stabilities. Generally, peptides were faster degraded in serum than in plasma, but surprisingly all peptides were more stable in fresh blood and the order of degradation rates among the peptides varied among the six different incubation experiments. This indicates, that proteolytic degradation of peptide-based therapeutics may often be misleading stimulating efforts to stabilize peptides at degradation sites relevant only in vitro, i.e., for serum or plasma stability assays, but of lower importance in vivo.

Abstract Proline‐rich antimicrobial peptides (PrAMPs) have been investigated and optimized by several research groups and companies as promising lead compounds to treat systemic infections caused by Gram‐negative bacteria. PrAMPs, such as apidaecins and oncocins, enter the bacteria and kill them apparently through inhibition of specific targets without a lytic effect on the membranes. Both apidaecins and oncocins were shown to bind with nanomolar dissociation constants to the 70S ribosome. In apidaecins, at least the two C‐terminal residues (Arg17 and Leu18) interact strongly with the 70S ribosome, whereas residues Lys3, Tyr6, Leu7, and Arg11 are the major interaction sites in oncocins. Oncocins inhibited protein biosynthesis very efficiently in vitro with half maximal inhibitory concentrations (IC 50 values) of 150 to 240 nmol L −1 . The chaperone DnaK is most likely not the main target of PrAMPs but it binds them with lower affinity.

ABSTRACT Background Colorectal cancer, one of the most common malignancies worldwide, is associated with a high mortality rate, mainly caused by metastasis. Comparative metagenome-wide analyses between healthy individuals and cancer patients suggest a role for the human intestinal microbiota. Nevertheless, which microbial molecules are involved in this communication is largely unknown, with current studies mainly focusing on short chain fatty acids and amino acid metabolites as potential mediators. However, quorum sensing peptides are not yet considered in this microbiome-host interaction: their in vivo presence nor any in vivo host-effect have been reported. Results For the first time, we showed that a quorum sensing peptide metabolite, EntF* produced by intestinal microbiota ( E. faecium ), is present in the blood circulation of mice. Moreover, it significantly promotes colorectal cancer metastasis in vivo , with metastatic lesions found in both liver and lung tissues, using an orthotopic mice model evaluating bioluminescence as well as macroscopic and microscopic presence of metastatic tumour nodules. In vitro tests on E-cadherin expression levels thereby indicated that the first, second, sixth and tenth amino acid of EntF* were critical for the epithelial-mesenchymal transition (EMT) effect, responsible for tumour metastasis. Conclusion This paper adds a new group of molecules, the quorum sensing peptides, as an additional causative factor explaining the microbiome-host interaction. The presence of a selected quorum sensing peptide (metabolite) in the mouse was proven for the first time and its in vivo effect on colorectal metastasis was demonstrated. We anticipate our in vivo results to be a starting point for broader microbiome-health investigations, not only limited to colorectal cancer metastasis, but also for developing novel bio-therapeutics in other disease areas, giving due attention to the QSP produced by the microbiome.

Abstract The GAIN domain is a hallmark of adhesion G-protein coupled receptors (aGPCRs) as this extracellular domain contains an integral agonistic sequence ( Stachel ) for activation via binding to the 7-transmembrane helical (7TM) domain of the receptor. Many aGPCRs are autoproteolytically cleaved at the GPCR proteolysis site (GPS) site within the GAIN domain formed HXS/T sequence motif. However, other aGPCR can be activated without GPS cleavage. We determined the crystal structure of the human ADGRB2/BAI2 hormone receptor (HormR) and GPCR autoproteolysis-inducing (GAIN) domains and found that this aGPCR is resistant to autoproteolysis despite the presence of a canonical HLS sequence motif at the GPS. We used structural comparisons and molecular dynamics (MD) simulations to identify structural determinants that are important for autocleavage beyond the canonical HXS/T motif. These studies characterized a conserved glycine residue and an edge-π interaction of the histidine base of the GPS sequence with a phenylalanine residue that is highly conserved in cleavage-competent aGPCRs. The MD simulations showed that this interaction is important to position the imidazole group of the histidine for deprotonation of the serine or threonine nucleophile. Removal of this interaction reduced autoprote-olytic activity in the ADGRL1 receptor and restored cleavage competence of the ADGRB3 receptor in a R866H/L821F double mutant. Conservation analysis indicates that wild-type ADGRB2 and ADGRB3 are auto-cleavage-incompetent receptors.

Abstract A 19-amino acid long p roline- r ich a nti m icrobial p eptide (PrAMP) Drosocin (Dro) is encoded in the fruit fly genome. Native Dro is glycosylated at a specific threonine residue, but the non-glycosylated peptide retains antibacterial activity. Dro shows sequence similarity to several other PrAMPs that bind in the ribosomal nascent peptide exit tunnel and inhibit protein synthesis by varying mechanisms. However, the target and mechanism of action of Dro remain unknown. Here we show that the primary mode of Dro action is inhibition of termination of protein synthesis. Our in vitro and in vivo experiments demonstrate that Dro stalls ribosomes at stop codons, likely sequestering class 1 release factors associated with the terminating ribosome. As the result, Dro strongly promotes readthrough of stop codons at subinhibitory concentrations. The elucidated mode of Dro action allows assigning it as the second member of the type II PrAMPs, of which only one representative, the antimicrobial peptide apidaecin (Api) produced by honeybees, was previously known. However, despite its functional similarity with Api, Dro interacts with the target in a markedly distinct way. The analysis of a comprehensive single-amino acid substitution library of endogenously expressed Dro variants shows that binding to the ribosome involves interactions of multiple amino acid residues distributed through the entire length of the PrAMP. Our data further show that the ribosome-targeting activity of non-glycosylated Dro can be significantly enhanced by single amino acid substitutions illuminating directions for improving its antibacterial properties.

Abstract Spliced fusion-transcripts are typically identified by RNA-seq without elucidating the causal genomic breakpoints. However, non poly(A)-enriched RNA-seq contains large proportions of intronic reads spanning also genomic breakpoints. Using 1.274 RNA-seq samples, we investigated what additional information is embedded in non poly(A)-enriched RNA-seq data. Here, we present our novel, graph-based, Dr. Disco algorithm that makes use of both intronic and exonic RNA-seq reads to identify not only fusion transcripts but also genomic breakpoints in gene but also in intergenic regions. Dr. Disco identified TMPRSS2-ERG fusions with genomic breakpoints and other transcribed rearrangements from multiple RNA-sequencing cohorts. In breast cancer and glioma samples Dr. Disco identified rearrangement hotspots near CCND1 and MDM2 and could directly associate this with increased expression. A comparison with matched DNA-sequencing revealed that most genomic breakpoints are not, or minimally, transcribed while also revealing highly expressed translocations missed by DNA-seq. By using the full potential of non poly(A)-enriched RNA-seq data, Dr. Disco can reliably identify expressed genomic breakpoints and their transcriptional effects.

Abstract The proline-rich antimicrobial designer peptide Api137 inhibits protein expression in bacteria by binding simultaneously to the ribosomal polypeptide exit tunnel and the release factor (RF), depleting the cellular RF pool and leading to ribosomal arrest at stop codons. This study investigates the additional effect of Api137 on the assembly of ribosomes using an Escherichia coli reporter strain expressing one ribosomal protein per 30S and 50S subunit tagged with mCherry and EGFP, respectively. Separation of cellular extracts derived from cells exposed to Api137 in a sucrose gradient reveals elevated levels of partially assembled and not fully matured precursors of the 50S subunit (pre-50S). High-resolution structures obtained by cryogenic electron microscopy demonstrate that a large proportion of pre-50S states are missing up to five proteins (uL22, bL32, uL29, bL23, and uL16) and have misfolded helices in 23S rRNA domain IV. These data suggest a second mechanism for Api137, wherein it disrupts 50S subunit assembly by inducing the formation of misfolded precursor particles potentially incapable of evolving into active ribosomes, suggesting a bactericidal mechanism.