TCR movement in the T cell plasma membrane is not well understood. Using three different types of microscopy, Davis and co-workers identify separate islands of Lat and TCR molecules that concatenate after T cell activation. The organization and dynamics of receptors and other molecules in the plasma membrane are not well understood. Here we analyzed the spatio-temporal dynamics of T cell antigen receptor (TCR) complexes and linker for activation of T cells (Lat), a key adaptor molecule in the TCR signaling pathway, in T cell membranes using high-speed photoactivated localization microscopy, dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy and transmission electron microscopy. In quiescent T cells, both molecules existed in separate membrane domains (protein islands), and these domains concatenated after T cell activation. These concatemers were identical to signaling microclusters, a prominent hallmark of T cell activation. This separation versus physical juxtapositioning of receptor domains and domains containing downstream signaling molecules in quiescent versus activated T cells may be a general feature of plasma membrane–associated signal transduction.

The use of a novel FRET-based imaging system provides an in situ view of the kinetics of T-cell receptor (TCR) binding to peptide MHC complexes in their natural environment, the immunological synapse. Previously the mater of how containment in this environment would affect the molecular interactions that drive cell–cell interactions has been a matter of speculation. Now that they have been measured, both expected effects (enhanced association rate due to optimal orientation) and unexpected (a very active cytoskeletal component destabilizing TCR binding) are revealed. This work is of relevance to T-cell immunology and to in cell–cell interactions more generally. T lymphocytes, which are an integral part of most adaptive immune responses, recognize foreign antigens through the binding of antigenic peptide–major histocompatibility complex (pMHC) molecules on other cells to specific T-cell antigen receptors (TCRs). Using single-molecule microscopy and fluorescence resonance energy transfer, the kinetics of TCR–pMHC binding are now measured in situ, revealing accelerated kinetics and increased affinity when compared with solution measurements. The recognition of foreign antigens by T lymphocytes is essential to most adaptive immune responses. It is driven by specific T-cell antigen receptors (TCRs) binding to antigenic peptide–major histocompatibility complex (pMHC) molecules on other cells1. If productive, these interactions promote the formation of an immunological synapse2,3. Here we show that synaptic TCR–pMHC binding dynamics differ significantly from TCR–pMHC binding in solution. We used single-molecule microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET) between fluorescently tagged TCRs and their cognate pMHC ligands to measure the kinetics of TCR–pMHC binding in situ. When compared with solution measurements, the dissociation of this complex was increased significantly (4–12-fold). Disruption of actin polymers reversed this effect, indicating that cytoskeletal dynamics destabilize this interaction directly or indirectly. Nevertheless, TCR affinity for pMHC was significantly elevated as the result of a large (about 100-fold) increase in the association rate, a likely consequence of complementary molecular orientation and clustering. In helper T cells, the CD4 molecule has been proposed to bind cooperatively with the TCR to the same pMHC complex. However, CD4 blockade had no effect on the synaptic TCR affinity, nor did it destabilize TCR–pMHC complexes, indicating that the TCR binds pMHC independently of CD4.

Abstract CD8+ T cell immunity to SARS-CoV-2 has been implicated in COVID-19 severity and virus control, though direct evidence has been lacking so far. Here, we identified non-synonymous mutations in MHC-I restricted CD8+ T cell epitopes after deep sequencing of 747 SARS-CoV- 2 virus isolates. Mutant peptides exhibited diminished or abrogated MHC-I binding, which was associated with a loss of recognition and functional responses by CD8+ T cells isolated from HLA-matched COVID-19 patients. Our findings highlight the capacity of SARS-CoV-2 to subvert CD8+ T cell surveillance through escape mutations in MHCI-restricted viral epitopes. This provides evolutionary evidence for CD8+ T cell immunity controlling SARS-CoV-2 with consequences for COVID-19 vaccine design.

ABSTRACT T-cells detect with their T-cell antigen receptors (TCRs) the presence of rare peptide/MHC complexes (pMHCs) on the surface of antigen presenting cells (APCs). How they convert a biochemical interaction into a signaling response is poorly understood, yet indirect evidence pointed to the spatial antigen arrangement on the APC surface as a critical factor. To examine this, we engineered a biomimetic interface based on laterally mobile functionalized DNA origami platforms, which allow for nanoscale control over ligand distances without interfering with the cell-intrinsic dynamics of receptor clustering. We found that the minimum signaling unit required for efficient T-cell activation consisted of two ligated TCRs within a distance of 20 nanometers, if TCRs were stably engaged by monovalent antibody fragments. In contrast, antigenic pMHCs stimulated T-cells robustly as well-isolated entities. These results identify the minimal requirements for effective TCR-triggering and validate the exceptional stimulatory potency of transiently engaging pMHCs.

ABSTRACT Molecular crowding of agonist peptide/MHC class II complexes (pMHCIIs) with structurally similar, yet per se non-stimulatory endogenous pMHCIIs has been postulated to sensitize T-cells for the recognition of single antigens on the surface of dendritic cells and B-cells. When testing this premise with the use of advanced live cell microscopy, we observed pMHCIIs as monomeric, randomly distributed entities diffusing rapidly after entering the APC surface. Synaptic TCR-engagement of highly abundant endogenous pMHCIIs was low or non-existent and affected neither TCR-engagement of rare agonist pMHCII in early and advanced synapses nor agonist-induced TCR-proximal signaling. Our findings highlight the capacity of single freely diffusing agonist pMHCIIs to elicit the full T-cell response in an autonomous and peptide-specific fashion with consequences for adaptive immunity and immunotherapeutic approaches. SHORT SUMMARY Platzer et al. revealed via highly quantitative and single molecule live cell microscopy the nature of peptide-loaded MHC class II molecules (pMHCII) as monomeric, densely populating, randomly distributed and predominantly rapidly diffusing entities on the surface of B-cells and dendritic cells. Low abundant stimulatory agonist pMHCII acted as autonomous units with the highest chance of T-cell detection when equally spread on APCs. The presence of bystander-pMHCII previously termed “co-agonist pMHC” affected neither synaptic agonist -TCR-binding nor efficiencies of T-cell recognition. “Co-agonist”-TCR-binding resembled random molecular collisions. Findings inform the design of T-cell-based immunotherapies.

Receptor-ligand interactions at cell interfaces initiate signaling cascades essential for cellular communication and effector functions. Specifically, T cell receptor (TCR) interactions with pathogen-derived peptides presented by the major histocompatibility complex (pMHC) molecules on antigen-presenting cells are crucial for T cell activation. The binding duration, or dwell time, of TCR-pMHC interactions correlates with downstream signaling efficacy, with strong agonists exhibiting longer lifetimes compared to weak agonists. Traditional surface plasmon resonance (SPR) methods quantify 3D affinity but lack cellular context and fail to account for factors like membrane fluctuations. In the recent years, single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) has been applied to measure 2D binding kinetics of TCR-pMHC interactions in a cellular context. Here, we introduce a rigorous mathematical model based on survival analysis to determine exponentially distributed receptor-ligand interaction lifetimes, verified through simulated data. Additionally, we developed a comprehensive analysis pipeline to extract interaction lifetimes from raw microscopy images, demonstrating the model's accuracy and robustness across multiple TCR-pMHC pairs. Our new software suite automates data processing to enhance throughput and reduce bias. This methodology provides a refined tool for investigating T cell activation mechanisms, offering insights into immune response modulation.