Abstract During Drosophila embryogenesis, the essential pioneer factor Zelda defines hundreds of cis -regulatory regions and in doing so reprograms the zygotic transcriptome. While Zelda is essential later in development, it is unclear how the ability of Zelda to define cis -regulatory regions is shaped by cell-type-specific chromatin architecture. Asymmetric division of neural stem cells (neuroblasts) in the fly brain provide an excellent paradigm for investigating the cell-type-specific functions of this pioneer factor. We show that Zelda synergistically functions with Notch to maintain neuroblasts in an undifferentiated state. Zelda misexpression reprograms progenitor cells to neuroblasts, but this capacity is limited by transcriptional repressors critical for progenitor commitment. Zelda genomic occupancy in neuroblasts is reorganized as compared to the embryo, and this reorganization is driven by differences in chromatin accessibility and cofactor availability. We propose that Zelda regulates essential transitions in the neuroblasts and embryo through a shared gene-regulatory network by defining cell-type-specific enhancers.

Abstract Following fertilization, the genomes of the germ cells are reprogrammed to form the totipotent embryo. Pioneer transcription factors are essential for remodeling the chromatin and driving the initial wave of zygotic gene expression. In Drosophila melanogaster , the pioneer factor Zelda is essential for development through this dramatic period of reprogramming, known as the maternal- to-zygotic transition (MZT). However, it was unknown whether additional pioneer factors were required for this transition. We identified an additional maternally encoded factor required for development through the MZT, GAGA Factor (GAF). GAF is necessary to activate widespread zygotic transcription and to remodel the chromatin accessibility landscape. We demonstrated that Zelda preferentially controls expression of the earliest transcribed genes, while genes expressed during widespread activation are predominantly dependent on GAF. Thus, progression through the MZT requires coordination of multiple pioneer-like factors, and we propose that as development proceeds control is gradually transferred from Zelda to GAF.

Abstract Diffuse midline gliomas and posterior fossa type-A ependymomas contain the highly recurrent histone H3 K27M mutation and the H3 K27M-mimic EZHIP, respectively. In vitro , H3 K27M and EZHIP are competitive inhibitors of Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) lysine methyltransferase activity. In vivo , these proteins reduce overall H3K27me3 levels, however residual peaks of H3K27me3 remain at CpG islands through an unknown mechanism. Here, we report that EZHIP and H3 K27M preferentially interact with an allosterically activated form of PRC2 in vivo . The formation of H3 K27M- and EZHIP-PRC2 complexes occurs at CpG islands containing H3K27me3 and impedes PRC2 and H3K27me3 spreading. While EZHIP is not found outside of placental mammals, we find that expression of human EZHIP reduces H3K27me3 in Drosophila melanogaster through a conserved molecular mechanism. Our results highlight the mechanistic similarities between EZHIP and H3 K27M in vivo and provide mechanistic insight for the retention of residual H3K27me3 in tumors driven by these oncogenes.

Abstract Chromatin is a barrier to the binding of many transcription factors. By contrast, pioneer factors access nucleosomal targets and promote chromatin opening. Despite binding to target motifs in closed chromatin, many pioneer factors display cell-type specific binding and activity. The mechanisms governing pioneer-factor occupancy and the relationship between chromatin occupancy and opening remain unclear. We studied three Drosophila transcription factors with distinct DNA-binding domains and biological functions: Zelda, Grainy head, and Twist. We demonstrated that the level of chromatin occupancy is a key determinant of pioneering activity. Multiple factors regulate occupancy, including motif content, local chromatin, and protein concentration. Regions outside the DNA-binding domain are required for binding and chromatin opening. Our results show that pioneering activity is not a binary feature intrinsic to a protein but occurs on a spectrum and is regulated by a variety of protein-intrinsic and cell-type-specific features.

Abstract/Summary The eukaryotic genome is organized to enable the precise regulation of gene expression required for development. This organization is established during early development when the embryo transitions from a fertilized germ cell to the totipotent zygote. To understand the factors and processes that drive genomic organization, we focused on the pioneer factor GAGA factor (GAF) that is required for early embryonic development in Drosophila. GAF transcriptionally activates the zygotic genome and is localized to subnuclear foci. We show that this non-uniform distribution is driven by binding to the highly abundant GA-satellite repeats. At GA-repeats, GAF is necessary to form heterochromatin and silence transcription. Thus, GAF is required to establish both active and silent regions. We propose that foci formation enables GAF to have opposing transcriptional roles within a single nucleus. Our data support a model in which modulation of the subnuclear concentration of transcription factors acts to organize the nucleus into functionally distinct domains that are essential for the robust regulation of gene expression.

The dramatic changes in gene expression required for development necessitate the establishment of cis -regulatory modules defined by regions of accessible chromatin. Pioneer transcription factors have the unique property of binding closed chromatin and facilitating the establishment of these accessible regions. Nonetheless, much of how pioneer transcription factors coordinate changes in chromatin accessibility during development remains unknown. To determine whether pioneer-factor function is intrinsic to the protein or whether pioneering activity is developmentally modulated, we studied the highly conserved, essential transcription factor, Grainy head (Grh). Grh is expressed throughout Drosophila development and functions as a pioneer factor in the larvae. We demonstrated that Grh remains bound to condensed mitotic chromosomes, a property shared with other pioneer factors. By assaying chromatin accessibility in embryos lacking either maternal or zygotic Grh at three stages of development, we discovered that Grh is not required for chromatin accessibility in early embryogenesis, in contrast to its essential functions later in development. Our data reveal that the pioneering activity of Grh is temporally regulated and is likely influenced by additional factors expressed at a given developmental stage.

Abstract Background Plasmodium knowlesi is now the major cause of human malaria in Malaysia, complicating malaria control efforts that must attend to the elimination of multiple Plasmodium species. Recent advances in the cultivation of P. knowlesi erythrocytic-stage parasites in vitro , transformation with exogenous DNA, and infection of mosquitoes with gametocytes from culture have opened up studies of this pathogen without the need for resource-intensive and costly non-human primate (NHP) models. For further understanding and development of methods for parasite transformation in malaria research, this study examined the activity of various trans-species transcriptional control sequences and the influence of Plasmodium vivax centromeric ( pvcen ) repeats in plasmid-transfected P. knowlesi parasites. Methods In vitro cultivated P. knowlesi parasites were transfected with plasmid constructs that incorporated P. vivax or Plasmodium falciparum 5’ UTRs driving the expression of bioluminescence markers (firefly luciferase or Nanoluc). Promoter activities were assessed by bioluminescence, and parasites transformed with human resistant allele dihydrofolate reductase-expressing plasmids were selected using antifolates. The stability of transformants carrying pvcen -stabilized episomes was assessed by bioluminescence over a complete parasite life cycle through a rhesus macaque monkey, mosquitoes, and a second rhesus monkey. Results Luciferase expression assessments show that certain P. vivax promoter regions, not functional in the more evolutionarily-distant P. falciparum , can drive transgene expression in P. knowlesi . Further, pvcen repeats may improve the stability of episomal plasmids in P. knowlesi and support detection of NanoLuc-expressing elements over the full parasite life cycle from rhesus macaque monkeys to Anopheles dirus mosquitoes and back again to monkeys. In assays of drug responses to chloroquine, G418 and WR9910, antimalarial half-inhibitory concentration (IC 50 ) values of blood stages measured by NanoLuc activity proved comparable to IC 50 values measured by the standard SYBR Green method. Conclusion All three P. vivax promoters tested in this study functioned in P. knowlesi whereas two of the three were inactive in P. falciparum . NanoLuc-expressing, centromere-stabilized plasmids may support high-throughput screenings of P. knowlesi for new antimalarial agents, including compounds that can block the development of mosquito- and/or liver-stage parasites.