Engineering improved B-family DNA polymerases to incorporate 3′-O-modified nucleotide reversible terminators is limited by an insufficient understanding of the structural determinants that define polymerization efficiency. To explore the key mechanism for unnatural nucleotide incorporation, we engineered a B-family DNA polymerase from Thermococcus Kodakaraenis (KOD pol) by using semi-rational design strategies. We first scanned the active pocket of KOD pol through site-directed saturation mutagenesis and combinatorial mutations and identified a variant Mut_C2 containing five mutation sites (D141A, E143A, L408I, Y409A, A485E) using a high-throughput microwell-based screening method. Mut_C2 demonstrated high catalytic efficiency in incorporating 3'-O-azidomethyl-dATP labeled with a Cy3 dye, whereas the wild-type KOD pol failed to incorporate it. Computational simulations were then conducted towards the DNA binding region of KOD pol to predict additional mutations with enhanced catalytic activity, which were subsequently experimentally verified. By a stepwise combinatorial mutagenesis approach, we obtained an eleven-mutation variant, named Mut_E10 by introducing additional mutations to the Mut_C2 variant. Mut_E10, which carried six specific mutations (S383T, Y384F, V389I, V589H, T676K, and V680M) within the DNA-binding region, demonstrated over 20-fold improvement in kinetic efficiency as compared to Mut_C2. In addition, Mut_E10 demonstrated satisfactory performance in two different sequencing platforms (BGISEQ-500 and MGISEQ-2000), indicating its potential for commercialization. Our study demonstrates that an effective enhancement in its catalytic efficiency towards modified nucleotides can be achieved efficiently through combinatorial mutagenesis of residues in the active site and DNA binding region of DNA polymerase. These findings contribute to a comprehensive understanding of the mechanisms that underlie the incorporation of modified nucleotides by DNA polymerase. The beneficial mutation sites, as well as the nucleotide incorporation mechanism identified in this study, can provide valuable guidance for the engineering of other B-family DNA polymerases.

Massively parallel sequencing (MPS) on DNA nanoarrays provides billions of reads at relatively low cost and enables a multitude of genomic applications. Further improvement in read length, sequence quality and cost reduction will enable more affordable and accurate comprehensive health monitoring tests. Currently the most efficient MPS uses dye-labeled reversibly terminated nucleotides (RTs) that are expensive to make and challenging to incorporate. Furthermore, a part of the dye-linker (scar) remains on the nucleobase after cleavage and interferes with subsequent sequencing cycles. We describe here the development of a novel MPS chemistry (CoolMPS™) utilizing unlabeled RTs and four natural nucleobase-specific fluorescently labeled antibodies with fast (30 sec) binding. We implemented CoolMPS™ on MGI′s PCR-free DNBSEQ MPS platform using arrays of 200nm DNA nanoballs (DNBs) generated by rolling circle replication and demonstrate 3-fold improvement in signal intensity and elimination of scar interference. Single-end 100-400 base and pair-end 2x150 base reads with high quality were readily generated with low out-of-phase incorporation. Furthermore, DNBs with less than 50 template copies were successfully sequenced by strong-signal CoolMPS ™ with 3-times higher accuracy than in standard MPS. CoolMPS™ chemistry based on natural nucleobases has potential to provide longer, more accurate and less expensive MPS reads, including highly accurate ″4-color sequencing″ on the most efficient dye-crosstalk-free 2-color imagers with an estimated sequencing error rate of 0.00058% (one error in 170,000 base calls) in a proof-of-concept demonstration.

Single tube long fragment read (stLFR) technology enables efficient WGS, haplotyping, and contig scaffolding. It is based on adding the same barcode sequence to sub-fragments of the original DNA molecule (DNA co-barcoding). To achieve this, stLFR uses the surface of microbeads to create millions of miniaturized compartments in a single tube. Using a combinatorial process over 1.8 billion unique barcode sequences were generated on beads, enabling practically non-redundant co-barcoding in reactions with 50 million barcodes. Using stLFR we demonstrate efficient unique co-barcoding of over 8 million 20-300 kb genomic DNA fragments with near perfect variant calling and phasing of the genome of NA12878 into contigs up to N50 23.4 Mb. stLFR represents a low-cost single library solution that can enable long sequence data.

Machine learning modelling assisting function-oriented enzyme engineering is normally built on predefined protein sequence space. However, efficient defining the determinant amino acid positions upon which the combinatorial mutation library is constructed is still a challenge in protein science. Herein, we present a comprehensive investigation of modifying a recombinant DNA polymerase for efficient incorporating one unnatural nucleotide, including the identification of key sites/regions, machine learning-assisted mutants screening, and the underlying mechanism of kinetics boosting. By using hundreds of training points and only dozens of testing samples, we found that one highly engineered enzyme’s catalytic efficiency can be further improved by one order of magnitude by specific mutation on two sites, 485I and 451L. Compared to the position 485 which is known to dominate local conformation of B-family DNA polymerases, 451 is a split-new active site discovered by our approach. A novel allosteric regulation mechanism is underlying the apparent synergy of 485I and 451L on the kinetics boosting. As a result, a “half-closed” conformation of the binding pocket and a cooperative binding of both primer and template DNA strands on the protein accelerated the processes of substrate’s incorporation, molecular recognition, and releasing of incorrect nucleotides. These findings have implications in guiding the function-tuning of DNA polymerases for a broad range of biotechnological applications.

Here we report a highly sensitive DNB-based on-chip Motif Finding (DocMF) system that utilizes high throughput next-generation-sequencing (NGS) chips to profile protein binding or cleaving activity. Using DocMF, we successfully identified a variety of endonuclease recognition sites and the protospacer-adjacent-motif (PAM) sequences of different CRISPR systems. Our DocMF platform can simultaneously screen both 5’ and 3’ PAM regions with high coverage using the same NGS library/chip. For the well-studied SpCas9, our DocMF platform identified a small proportion of noncanonical 5’-NAG-3’ (∼5%) and 5’-NGA-3’ (∼1.6%), in addition to its common PAMs, 5’-NGG-3’ (∼89.9%). We also used the DocMF to assay two uncharacterized Cas endonucleases, VeCas9 and BvCpf1. VeCas9 PAMs were not detected by the conventional PAM depletion method. However, DocMF discovered that both VeCas9 and BvCpf1 required broader and more complicated PAM sequences for target recognition. VeCas9 preferred the R-rich motifs, whereas BvCpf1 used the T-rich PAMs. Moreover, after slightly changing the experimental protocol, we observed that dCas9, a DNA-binding protein lacking endonuclease activity, preferably binded to the previously reported PAMs 5’-NGG-3’. In summary, our studies demonstrate that DocMF is the first tool with the capacity to exhaustively assay both the binding and the cutting properties of different DNA-binding proteins.